Summary
En
Abstract
Hjärnans normala funktion är beroende inte bara på embryonal utveckling när stora neuronala banor är etablerade, men också på postnatal utveckling när neurala kretsar är mognat och förfinats. Misregulation i detta skede kan leda till neurologiska och psykiatriska sjukdomar som autism och schizofreni 1,2. Många gener har studerats i prenatal hjärnan och funnit avgörande betydelse för många utvecklingsprocesser 3-5. Dock är deras funktion i den postnatala hjärnan i stort sett okända, dels för att de raderas på möss ofta leder till dödlighet under neonatal utveckling, dels därför att deras krav i tidiga utveckling hämmar den postnatala analysen. För att övervinna dessa hinder är floxed alleler av dessa gener för närvarande genereras i möss 6. I kombination med transgena alleler som uttrycker Cre recombinase i specifika celltyper kan villkorliga radering uppnås för att studera geners funktion i den postnatala hjärnan. Detta kräver dock att metoden ytterligare alleler och extra tid (3-6 månader) för att generera möss med lämpliga genotyper, vilket begränsar utbyggnaden av genetisk analys för att i stor skala i musen hjärnan.
Här visar vi en kompletterande strategi som använder viralt-uttryckta Cre att studera dessa floxed alleler snabbt och systematiskt i postnatala hjärnans utveckling. Genom att injicera rekombinant Adeno-associerad virus (rAAVs) 7,8 kodning Cre i neonatal hjärnan kan vi ta bort genen av intresse i olika regioner av hjärnan. Genom att kontrollera virus titer och coexpressing ett fluorescerande protein markör, kan vi uppnå samtidigt inaktivering mosaik gen och gles neuronala märkning. Denna metod kringgår kravet på många gener i tidig utveckling och ger oss möjlighet att studera deras cell självständig funktion i många viktiga processer i postnatala hjärnans utveckling, inklusive axonal och dendritiska tillväxt, förgrening och plattsättning samt synaps bildning och förfining. Denna metod har använts framgångsrikt i vårt eget labb (opublicerade resultat) och andra 8,9, och kan utvidgas till andra virus, såsom lentivirus 9, samt ett uttryck för shRNA eller dominerande aktiva proteiner 10. Genom att kombinera denna teknik med elektrofysiologi samt nyligen utvecklade optisk bildframställning 11, ger denna metod en ny strategi för att studera hur genetiska vägar att påverka neural krets utveckling och funktion hos möss och råttor.
Protocol
1. Förbereda virus för injektion
- rAAVs köptes från den rekommenderade kommersiell leverantör, men de kan också framställas i sitt eget laboratorium (se nedan). Viruset Lösningen är normalt produceras i en titer på ~ 1x10 12 genomet kopior per milliliter (GC / ml) och kan användas på full titer att manipulera ett stort antal celler. Alternativt kan spädas för att producera önskad nivå av glesa märkning. Den tillämpliga utspädningen måste bestämmas av användaren, men en 1:10 spädning rekommenderas att starta.
- Tina virus på is omedelbart före användning. Överför önskad utspädning volym viruset lösningen till en liten (~ 250μl) PCR-rör. Späd viruset lösningen med lämplig volym sterilt DPBS i en vävnad kultur huva. Förvara utspädd virus lösningen på is tills det behövs.
OBS: bör hantering av alla virus genomföras i enlighet med ett biosäkerhetsprotokollet godkänd av din institution
2. Spruta lastning och utrustning för montering
- Anslut lastning nålen till glassprutan och upprätta viruset lösning från PCR-röret genom att försiktigt dra kolven. Dra ut kolven tills en mycket liten luftbubbla kan ses i sprutan, detta tyder på att all lösning i sprutan och är inte kvar i lastning nålen. Alternativt kan en liten mängd inert färgämne läggas till lösning för att göra det synligt.
OBS: En liten PCR-rör bör användas som lastning nålen är normalt inte tillräckligt lång för att nå botten på de flesta andra rör. - Ta bort lastning nålen och lägg sprutan på sprutan block av en sprutpump, säkra den med sprutan hållare.
- Försiktigt in ena änden av sammanbindande slangen i sprutan, sätt in den andra änden i nål. För in injektionsnålen i nål. I slutet av kanylen bör direkt kontakt i slutet av bindväv slangen insidan av nål.
- Tryck långsamt in kolven manuellt för att driva lösning genom sammanbindande slangen. Tryck tills en liten droppe lösning syns på spetsen av kanylen.
- Sätt försiktigt kolven intill pusher blocket och fäst den på plats med pusher blocket fästet.
- Ställ injektionen parametrar: insprutningshastighet bör vara ungefär 8μl/min (~ 130nl / s), injektionsvolym är normalt 1-2ul, välja lämplig spruta diameter sprutan som du använder (se manualen sprutpumpen för riktlinjer).
- Ställ in kokplattan till ~ 38 ° C och täck med en pappershandduk eller andra tunna barriär för att skydda valparna under återhämtningsfasen.
3. Injektionsproceduren och ungar återhämtning
- Förbered P0 P1 mus ungar för injektion genom att utsätta dem för kyla bedövning efter en IACUC godkänt protokoll. Fukta ett par pappershanddukar med vatten och placera på is. Placera önskat antal valpar (4-5) på hushållspapper (hålla dem väl separerade) och försiktigt vika pappershanddukar över ungarna så att de täcks av fuktig pappershandduk. Placera försiktigt en liten mängd krossad is på toppen av pappershanddukar och inkubera valparna i ca 5 minuter. Valparna kan hållas på is i upp till 15 minuter och återhämta sig fint efteråt.
- När valpen är tillräckligt sövda, placera den på en Monteringskloss (vi använder ett frigolit block som vanligtvis rymmer 15 ml rör) och placera den för bästa åtkomst till injektionsstället. För cortex är det enklast att lägga djuret platt på magen, medan lillhjärnan är det bra att placera valpens huvud över kanten av blocket för att ge bättre tillgång till den bakre delen av skallen. Valpen kan fästas på plats med ett band-stöd, om så önskas.
- Håll valpens huvud på plats med en hand medan nålen manuellt in genom skallen på önskad plats med den andra handen. Det är bra att dra i huden stram för att förhindra den från att röra sig under injektion. För cortex är det bra att göra injektioner i förhållande till en väl definierad anatomiska landmärke, såsom lambda sutur av skallen, eftersom detta stöd i framtiden injektioner. Lillhjärnan kan ses genom skallen som en tunn remsa av vävnad ligger direkt caudal till colliculi. Djupet som nålen ska sättas in varierar något mellan enskilda djur och stammar och kan mätas genom förutbestämda markörer på nålen, men för hjärnbarken samt i lillhjärnan vi finner att ett djup på ~ 0,5 - 1 mm från ytan är vanligen lämpligt. Införandet djup för andra webbplatser bör bestämmas experimentellt av slutanvändaren.
OBS: Nålen skall lätt tränga in i skallen, om det inte, inte trycka för hårt eftersom det kan skada djuret. Flytta nålen och försiktigt försök igen. - Injicera viruset lösningen. Injektionen är att börjaED genom att trycka på START-knappen på pumpen eller deprimerande en fotpedal, beroende på modell av tryck injektor används. I avsaknad av en fotpedal rekommenderas det att man har en kollega hjälpa till med att trycka på knappen för att minimera onödiga handrörelser som kan påverka injektionen.
- Efter den valda volymen har injicerats, hålla nålen på plats i några sekunder och sedan försiktigt bort nålen genom att skjuta ut den jämnt. Var noga med att hålla valpen huvud för att minimera yttre rörelser. Eftersom injektionen utrustningen rengöras och steriliseras mellan experiment med etanol och såret är liten, är användningen av antiseptisk onödigt.
- Placera valpen på den täckta värmeplatta med temperaturen inställd på ~ 38 ° C för att värma upp det för återvinning, vanligtvis 5-10 minuter. Under denna tid kan du fortsätta att injicera andra valpar.
- Efter alla av valparna har återhämtat sig (de ska vara rosa och rörliga) Ta en del av hemmet sängkläder och försiktigt gnugga valparna med det. Återgå valparna till modern som grupp.
OBS: Det är mycket viktigt att se till att ungarna är varma och utsätts för hem sängkläder innan du returnerar dem till mamma och lämna tillbaka dem som en grupp. Underlåtenhet att göra detta kan resultera i att mamman skada eller döda valparna.
4. Utrustning rengöring
- Efter injektionen är klar och valparna har återvänt till sin mor, rengör injektionsstället installationen genom att till fullo ladda sprutan med aceton eller 70% etanol. Spola lösning genom flera injektion ställtider, med hjälp av ny lösning varje gång. Detta tar bort eventuellt kvarvarande virus lösning och utfällningar. Den aceton eller etanol kommer då avdunsta.
OBS: Aceton är att föredra för rengöring, men om din setup använder någon aceton-känsliga komponenter, till exempel cyanoakrylatlim, sedan använda 70% etanol för dessa steg. - Desinficera arbetsytan med blekmedel och kasta avfall i en lämplig behållare för biologiskt behållare.
5. Analys
- Offra djuren på önskad ålder med hjälp av en IACUC godkänd dödshjälp metod. Perfusion fixering rekommenderas att stöd i senare visualisering av infekterade nervceller, särskilt i vuxna djur.
- Standard immunfärgning procedurer kan användas för att förstärka fluorescerande signal. Kortfattat är 100 ìm flytande vibratome sektioner permeabilized med PBS 1% Triton X-100 och blockerade i PBS 1% Triton X-100 10% normal get serum. Sektioner inkuberas i blockerande lösningen med primära antikroppar över natten vid 4 ° C, följt av ytterligare tvätt och blockering. Avsnitten inkuberas därefter i blockerande lösningen med sekundära antikroppar i 2 timmar i rumstemperatur, tvättas noggrant, monterade på diabilder och täckas med anti-fade montering media. Kryosnitt kan också användas för att visualisera märkta nervceller, men den endogena fluorescens kan gå förlorade.
6. Representativa resultat:
En lyckad injektion förfarande kommer att producera robusta infektion av nervceller i regionen injektionsstället med några observerbara vävnadsskada eller andra skadeverkningar på djuret. Som visas i figur 1, kan spridningen av infektionen observeras i Cre-reporter möss (ROSA26R) 12 injiceras med rAAV8-Cre i olika anatomiska områden. Injektioner i vissa regioner, som cortex och överlägsen colliculi, vanligtvis genererar lokala infektioner med minimal spridning till angränsande regioner (bild 1A-B). Användning av hög titer virus lösning gör infektion i angränsande områden, exempelvis hippocampus, mer troligt (Fig. 1A). Injektion med låga lösning titer virus resultat i glesa infektion, som normalt är i närheten av injektionsstället, som visas i lillhjärnan injektion av rAAV8-Cre vid mittlinjen ROSA26R reporter möss (Figur 1C-D). Vi har sett rekombination i ROSA26R reporter möss inom 2 dagar efter injektion av rAAV8-CRE, vilket tyder på att infektion, rekombination och uttryck av reporter gener alla kan inträffa relativt snabbt. Dessutom har vi framgångsrikt använt denna teknik för att studera effekterna av gendeletion på en icke-ROSA locus med en floxed villkorlig allelen kommer resultaten som publiceras någon annanstans.
Antalet infekterade celler bör korrelera med titer av det injicerade virus lösningen. Till exempel injicera en blandning av hög titer lösningar av två rAAV8 virus som uttrycker olika fluorescerande proteiner i lillhjärnan infekterar många Purkinje celler som differentiellt är märkta (Fig. 2A). Omvänt kan injicera en liten lösning titer virus resultera i glesa infektionen till stöd visualisera enstaka celler (Fig. 2B). Fluorescerande nervceller kan observeras direkt i nyklippt, levande vävnad (Fig. 2B) eller kan utsättas för immunfärgning för att öka den endogena fluorescerande signaler för senare bilden förvärvar brett fält eller confocal fluorescerande mikroskopi (Fig. 2A, FIG. 3A-C). Slutligen är rAAV8 kan infektera en rad olika neuron typer i cortex med starka märkning av fina processer (Fig. 3A-C).
Figur 1: LacZ färgning i hjärnan hos ROSA26R reporter möss som injicerades med rAAV8-Cre på P0 visar Cre aktivitet och placeringen av infektion.
- Wide-området sagittala bild av en P14 hjärnan visar hög titer (1x10 12 GC / ml) injektioner i hjärnbarken och överlägsen colliculi. Användningen av hög titer viruset gör det mer troligt att närliggande områden också kommer att bli smittade.
- Sagittala avsnitt av P14 cortex injiceras med lägre titer (1x10 11 GC / ml)-viruset visar en lokal infektion med mindre spridning.
- En wholemount syn på en P28 lillhjärnan injiceras vid mittlinjen med låg titer (1x10 9 GC / ml) virus lösning visar att infektionen är gles och vanligen förblir nära injektionsstället.
- Sagittala utsikt över mittlinjen av lillhjärnan i C). Observera att i allmänhet endast Purkinje celler är infekterade av rAAV8.
Figur 2: Cerebellar märkning som injektion med hög och låg titer av rAAV8 uttrycka fluorescerande proteiner.
- En sagittala del av P21cerebellum infekterade med en blandning av två virus som uttrycker EGFP (grön) och DsRed (röd). En hög titer blandning av virus som användes för att infektera ett stort antal Purkinje celler.
- En Purkinje cell i levande P14 lillhjärnan från mycket låg titer virusinfektion avbildas direkt efter dissekering.
Figur 3: Bark-märkning av rAAV8-DsRed.
Exempel på olika kortikala neuron typer i koronala delar av en P21 hjärnbarken som var infekterade av rAAV8 DsRed-at P0.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den neonatala virala injektion metod som presenteras här ger ett enkelt och snabbt sätt att generera in vivo mosaiker för studier av postnatal hjärnans utveckling. Metoden drar nytta av floxed alleler som är tillgängliga samt de som görs genom den höge genomströmning riktad genmodifiering projektet 6. Jämfört med användningen av transgena uttryck för CRE, ger denna metod ett snabbt sätt att testa geners funktion i olika celltyper, som möss bär floxed alleler kan användas direkt för experiment, och hela viruset injektionsproceduren från början till slut kan åstadkommit i mindre än en timme. Dessutom kan antalet infekterade celler enkelt kontrolleras genom att ändra titer av viruset, vilket gör att glesa märkning av enskilda nervceller. Även om vi bara beskrivit neuronal morfologi i provet bilder kan analysen av infekterade nervceller utökas till många viktiga utvecklingsprocesser, även axonal och dendritiska tillväxten, förgrening och plattsättning samt synaptiska utveckling som ryggraden morfogenes.
De tre mest kritiska delarna av förfarandet är korrekt inriktning på injektionsstället, tillförlitlighet injektionsutrustning, och överlevnaden av avkomman. Den första aspekten - noggrannhet - är bäst lärt sig genom erfarenhet. Tillförlitligheten i injektionsutrustning hänvisar till det faktum att man måste se till det finns inga träskor, läckage eller andra problem med utrustningen före injektion. Slutligen är överlevnad av avkomman vanligtvis inte ett problem om de tips som nämns i steg 3,7 följs.
En uppenbar förändring av detta förfarande är att använda en blandning av virus som uttrycker olika gener. Till exempel kan en blandning av två virus, rAAV-Cre-GFP och rAAV-RFP, injiceras för att producera en mosaik av glest märkt knockout (grön) och kontroll (röd) celler i ett enskilt djur. Detta ger en klar fördel jämfört med traditionella gen knockouts för analys av enskilda celler, vilket gör det särskilt användbart för morfologisk analys av nervceller med vildtyp eller mutant alleler i samma mus hjärnan. Detta kan också vara en begränsning, men om man vill utföra beteendestudier, i vilka det kan vara nödvändigt att manipulera ett stort antal nervceller för att en märkbar effekt. Vi finner att vi i allmänhet kan utföra injektioner upp till postnatal ålder 3 (P3), dock från ålder P4 och på skallen är ofta för tjock för att enkelt sticka hål med kanylen. Tjockleken på skallen vid en viss ålder kan variera från djur till djur, dock så denna fråga måste bedömas av försöksledaren.
Förutom att använda fluorescerande proteiner uttrycks från Cre-uttrycker viruset har varit många lysrör reporter möss med loxP-STOP-loxP alleler genererade 13 och kan införlivas med floxed allel. Även om man inkluderar den nya allelen lägger den tid som behövs för att erhålla möss med lämpliga genotyper kan dessa reporter möss bildskärm samtidigt Cre aktivitet och etikett nervceller individ.
På grund av den selektiva tropism av rekombinant rAAVs kan olika neuronala celltyper märkas i anatomiska regioner genom att välja en viss rAAV serotyp (figur 1D). Specificiteten kan också uppnås med hjälp av olika promotorer. Dessutom kan andra virus, såsom lentivirus, användas för att infektera nervceller 10. Fördelen här är att dessa virus kan transportera större DNA skär att uttrycka inte bara Cre men även andra genetiska material, såsom shRNA och dominerande aktiva gener. Dessutom kan metoden också användas i den nyutvecklade transgena råttor 14, där villkorligt uttryckt Cre linjer inte är väletablerade. Slutligen, när denna teknik är etablerad i labbet, kan det dessutom kombineras med andra analysverktyg, som in vivo-två-photon imaging 11 och / eller elektrofysiologi, för att studera funktionen av varje gen i neurala kretsen utveckling och funktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av en RO1 anslag från NIH (NINDS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| rAAV8-Cre, -GFP, -DsRed, | Vector Biolabs | #7060, #7061, custom order | http://www.vectorbiolabs.com |
| Harvard Pump 11 Plus | Harvard Apparatus | #702208 | (No foot pedal port) |
| Retinal Pigment Epithelium Injection Kit | World Precision Instruments, Inc. | RPE-KIT | Contains connective tubing, injection needles (36G), and needle holder |
| NanoFil Syringe, 100μl | World Precision Instruments, Inc. | NANOFIL-100 | Includes reusable loading needle |
| D-PBS | Invitrogen | 14040-117 | |
| GFP antibody | Aves | GFP-1020 | |
| DsRed antibody | Clontech Laboratories | 632496 | |
| Heating Block | VWR international | 97042-610 | |
| ROSA26R mouse | Jackson Laboratory | 003309 |
References
- Geschwind, D. H., Levitt, P. Autism spectrum disorders: developmental disconnection syndromes. Curr Opin Neurobiol. 17, 103-111 (2007).
- Giedd, J. N., Rapoport, J. L. Structural MRI of pediatric brain development: what have we learned and where are we going? Neuron. 67, 728-734 (2010).
- Chedotal, A., Richards, L. J. Wiring the brain: the biology of neuronal guidance. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).
- Shen, K., Cowan, C. W. Guidance molecules in synapse formation and plasticity. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).
- Chen, S. Y., Cheng, H. J. Functions of axon guidance molecules in synapse formation. Curr Opin Neurobiol. 19, 471-478 (2009).
- Guan, C., Ye, C., Yang, X., Gao, J. A review of current large-scale mouse knockout efforts. Genesis. 48, 73-85 (2010).
- Tenenbaum, L. Recombinant AAV-mediated gene delivery to the central nervous system. J Gene Med. 6, 212-222 (2004).
- Broekman, M. L., Comer, L. A., Hyman, B. T., Sena-Esteves, M. Adeno-associated virus vectors serotyped with AAV8 capsid are more efficient than AAV-1 or -2 serotypes for widespread gene delivery to the neonatal mouse brain. Neuroscience. 138, 501-510 (2006).
- Pilpel, N., Landeck, N., Klugmann, M., Seeburg, P. H., Schwarz, M. K. Rapid reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain. J Neurosci Methods. 182, 55-63 (2009).
- Szulc, J., Aebischer, P. Conditional gene expression and knockdown using lentivirus vectors encoding shRNA. Methods Mol Biol. 434, 291-309 (2008).
- Pan, F., Gan, W. B. Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex. Dev Neurobiol. 68, 771-778 (2008).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21, 70-701 (1999).
- Madisen, L. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13, 133-1340 (2010).
- Tong, C., Li, P., Wu, N. L., Yan, Y., Ying, Q. L. Production of p53 gene knockout rats by homologous recombination in embryonic stem cells. Nature. 467, 211-213 (2010).
