Summary

Virüs tabanlı Cre Rekombinasyon kullanarak Postnatal Fare Beyin Gelişimi Gen Fonksiyonu Mosaic Analizi

Published: August 01, 2011
doi:

Summary

Bir<em> In vivo</em> Postnatal beyin gen fonksiyon testi yöntemi açıklanmıştır. Cre ve / veya floresan proteini ifade Rekombinant AAVs yenidoğan fare beyninin içine enjekte edilir. Mozaik gen inaktivasyonu ve seyrek nöronal etiketleme, gen fonksiyonu nöral devre geliştirme kritik süreçlerin hızlı analiz izin elde edilir.

Abstract

Normal beyin fonksiyonu, sinir devreleri olgunlaştı ve rafine zaman doğum sonrası gelişim üzerinde de sadece büyük nöronal yollarda kurulan embriyonik gelişim dayanır, ama. Bu aşamada Misregulation gibi otizm ve şizofreni 1,2 gibi nörolojik ve psikiyatrik bozukluklara yol açabilir. Birçok genin prenatal beyin okudu ve birçok gelişim süreçleri 3-5 için çok önemlidir bulundu. Ancak, doğum sonrası beyin işlevi farelerde silinmesi genellikle neonatal gelişim sırasında ölümcül götüren kısmen ve erken gelişim kendi ihtiyacı postnatal analiz engellemektedir kısmen, büyük ölçüde bilinmemektedir. Bu engelleri aşmak için, bu genlerin floxed allel farelerde 6 oluşturulan ediliyor. Ifade Cre recombinase belirli hücre tipleri, koşullu silme postnatal beyin gen fonksiyonu çalışma elde edilebilir ki transgenik allel ile birleştirildiği zaman. Ancak bu yöntem, böylece fare beyni büyük bir ölçekte genetik analiz genişleme sınırlama, uygun genotipler ile fareler üretmek için ek allelleri ve ekstra zaman (3-6 ay) gerektirmektedir.

Burada postnatal beyin geliştirme, hızlı ve sistematik bir şekilde bu floxed allel çalışma viral-ifade Cre kullanan tamamlayıcı bir yaklaşım göstermektedir. Rekombinant adeno-ilişkili virüs (rAAVs) 7,8 kodlama Cre neonatal beyin içine enjekte edilerek, beynin farklı bölgelerinde ilgi gen silebilir. Viral titresi kontrol ve floresan protein işaretleyici coexpressing, biz aynı zamanda mozaik gen inaktivasyonu ve seyrek nöronal etiketleme elde edebilirsiniz. Bu yöntem, erken geliştirme birçok genin gereksinimi, dallanma ve döşeme, sinaps oluşumu ve arıtmanın yanı sıra, atlar ve bize aksonal ve dendritik büyüme de dahil olmak üzere, doğum sonrası beyin gelişiminde çok kritik süreçlerin kendi hücre otonom fonksiyon, çalışma sağlar. Bu yöntem, kendi laboratuvarı (yayınlanmamış) ve diğerleri 8,9 başarıyla kullanılmaktadır ve lentivirüs 9 yanı sıra, shRNA veya baskın olarak aktif proteinlerdeki 10 ifade gibi diğer virüsler, uzatılabilir . Ayrıca, elektrofizyoloji bu tekniği birleştiren yanı sıra yakın zamanda geliştirilen optik görüntüleme araçları 11 genetik yollar fare ve sıçanlarda sinir devresi gelişimi ve işlevi nasıl etkilediğini incelemek için yeni bir strateji, bu yöntem sağlar .

Protocol

1. Enjeksiyon için hazırlanması virüsler rAAVs önerilen ticari bir satıcıdan satın alındı, ancak kişinin kendi laboratuarında imal edilebilir onlar da (aşağıya tartışma bakınız). Virüs çözümü genellikle mililitrede ~ 1×10 12 genom kopya (GC / ml) bir titrede üretilir ve tam titresi hücrelerinin çok sayıda işlemek için kullanılan olabilir. Alternatif olarak, seyrek etiketleme istenilen düzeyde üretmek için seyreltilmiş olabilir. Kullanıcı tarafından belirlenen u…

Discussion

Burada sunulan yenidoğan viral enjeksiyon yöntemi, doğum sonrası beyin gelişimi ve çalışması için in vivo mozaikleri oluşturmak için basit ve hızlı bir şekilde sağlar . Bu yöntem yanı sıra şu anda proje 6 Hedefleme Yüksek Verimli Gen yoluyla alınıyor olduğunu mevcuttur floxed allellerin yararlanır . Cre transgenik ifade kullanımı ile karşılaştırıldığında, bu yöntem floxed allel taşıyan fareleri deneyler için doğrudan kullanılabildiği gibi, çeşitli hücre ti…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma bir RO1 NIH (NINDS) hibesi ile desteklenmektedir.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
rAAV8-Cre, -GFP, -DsRed, Vector Biolabs #7060, #7061, custom order http://www.vectorbiolabs.com
Harvard Pump 11 Plus Harvard Apparatus #702208 (No foot pedal port)
Retinal Pigment Epithelium Injection Kit World Precision Instruments RPE-KIT Contains connective tubing, injection needles (36G), and needle holder
NanoFil Syringe, 100μl World Precision Instruments NANOFIL-100 Includes reusable loading needle
D-PBS Invitrogen 14040-117  
GFP antibody Aves GFP-1020  
DsRed antibody Clontech 632496  
Heating Block VWR 97042-610  
ROSA26R mouse Jackson Laboratory 003309  

References

  1. Geschwind, D. H., Levitt, P. Autism spectrum disorders: developmental disconnection syndromes. Curr Opin Neurobiol. 17, 103-111 (2007).
  2. Giedd, J. N., Rapoport, J. L. Structural MRI of pediatric brain development: what have we learned and where are we going?. Neuron. 67, 728-734 (2010).
  3. Chedotal, A., Richards, L. J. Wiring the brain: the biology of neuronal guidance. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).
  4. Shen, K., Cowan, C. W. Guidance molecules in synapse formation and plasticity. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).
  5. Chen, S. Y., Cheng, H. J. Functions of axon guidance molecules in synapse formation. Curr Opin Neurobiol. 19, 471-478 (2009).
  6. Guan, C., Ye, C., Yang, X., Gao, J. A review of current large-scale mouse knockout efforts. Genesis. 48, 73-85 (2010).
  7. Tenenbaum, L. Recombinant AAV-mediated gene delivery to the central nervous system. J Gene Med. 6, 212-222 (2004).
  8. Broekman, M. L., Comer, L. A., Hyman, B. T., Sena-Esteves, M. Adeno-associated virus vectors serotyped with AAV8 capsid are more efficient than AAV-1 or -2 serotypes for widespread gene delivery to the neonatal mouse brain. Neuroscience. 138, 501-510 (2006).
  9. Pilpel, N., Landeck, N., Klugmann, M., Seeburg, P. H., Schwarz, M. K. Rapid reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain. J Neurosci Methods. 182, 55-63 (2009).
  10. Szulc, J., Aebischer, P. Conditional gene expression and knockdown using lentivirus vectors encoding shRNA. Methods Mol Biol. 434, 291-309 (2008).
  11. Pan, F., Gan, W. B. Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex. Dev Neurobiol. 68, 771-778 (2008).
  12. Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21, 70-701 (1999).
  13. Madisen, L. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13, 133-1340 (2010).
  14. Tong, C., Li, P., Wu, N. L., Yan, Y., Ying, Q. L. Production of p53 gene knockout rats by homologous recombination in embryonic stem cells. Nature. 467, 211-213 (2010).

Play Video

Cite This Article
Gibson, D. A., Ma, L. Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination. J. Vis. Exp. (54), e2823, doi:10.3791/2823 (2011).

View Video