Summary
Une
Abstract
Fonctionnement normal du cerveau repose non seulement sur le développement embryonnaire où les grandes voies neuronales sont établis, mais aussi sur le développement postnatal lorsque les circuits neuronaux sont élevés et raffinée. Le dérèglement à ce stade peut entraîner des troubles neurologiques et psychiatriques comme l'autisme et la schizophrénie 1,2. De nombreux gènes ont été étudiés dans le cerveau prénatal et trouve cruciale pour de nombreux processus développementaux 3-5. Cependant, leur fonction dans le cerveau postnatal est largement inconnu, en partie parce que leur suppression chez la souris conduit souvent à la létalité au cours du développement néonatal, et en partie parce que leur condition en début de développement entrave l'analyse post-natal. Pour surmonter ces obstacles, les allèles floxés de ces gènes sont actuellement générés chez des souris 6. Lorsqu'il est combiné avec des allèles transgéniques qui expriment la recombinase Cre dans des types cellulaires spécifiques, suppression conditionnelle peut être réalisé pour étudier la fonction des gènes dans le cerveau postnatal. Cependant, cette méthode nécessite allèles supplémentaires et du temps supplémentaire (3-6 mois) pour générer des souris avec des génotypes appropriés, limitant ainsi l'expansion de l'analyse génétique à grande échelle dans le cerveau de souris.
Ici nous démontrons une approche complémentaire qui utilise viro-Cre exprimée d'étudier ces allèles floxés rapidement et systématiquement dans le développement du cerveau postnatal. En injectant recombinant virus adéno-associés (rAAVs) 7,8 encodage Cre dans le cerveau néonatal, nous sommes capables de supprimer le gène d'intérêt dans les différentes régions du cerveau. En contrôlant le titre viral et la co-exprimant un marqueur fluorescent protein, nous pouvons atteindre simultanément l'inactivation du gène mosaïque et clairsemés étiquetage neuronale. Cette méthode contourne l'exigence de nombreux gènes dans le développement précoce, et nous permet d'étudier leur fonction de cellules autonomes dans de nombreux processus essentiel dans le développement du cerveau postnatal, y compris la croissance axonale et dendritique, de branchement, et le carrelage, ainsi que la formation des synapses et de raffinement. Cette méthode a été utilisée avec succès dans notre propre laboratoire (résultats non publiés) et d'autres 8,9, et peut être étendue à d'autres virus, tels que des lentivirus 9, ainsi que l'expression de shRNA ou dominant des protéines actives 10. Par ailleurs, en combinant cette technique avec l'électrophysiologie ainsi que récemment développé des outils d'imagerie optique 11, cette méthode fournit une nouvelle stratégie pour étudier comment les voies génétiques influencent le développement des circuits neuronaux et la fonction chez les souris et les rats.
Protocol
1. Préparation de l'injection des virus
- rAAVs ont été achetés auprès du fournisseur recommandé commerciaux, mais ils peuvent aussi être produits dans son propre laboratoire (voir la discussion ci-dessous). La solution de virus est généralement produit à un titre de ~ 1x10 12 copies du génome par millilitre (GC / ml) et peut être utilisé à titre complet à manipuler un grand nombre de cellules. Alternativement, ils peuvent être dilués pour obtenir le niveau désiré de l'étiquetage clairsemé. La dilution appropriée doit être déterminée par l'utilisateur, mais une dilution de 1:10 est recommandé de commencer.
- Dégel des virus sur la glace immédiatement avant utilisation. Transférer le désiré pré-dilution du volume de la solution de virus dans un petit (~ 250μl) tube de PCR. Diluer la solution de virus en utilisant un volume approprié de DPBS stérile dans une hotte de culture de tissus. Magasin de solution de virus dilué sur la glace jusqu'à ce qu'elle soit nécessaire.
REMARQUE: la manipulation de tous les virus doivent être menées conformément à un protocole sur la biosécurité approuvé par votre institution
2. Chargement de seringues et assemblage d'équipements
- Connectez l'aiguille de chargement à la seringue en verre et d'élaborer la solution de virus du tube de PCR en tirant doucement sur le piston. Tirez le piston jusqu'à ce qu'une bulle d'air très faible peut être vu dans la seringue, ce qui indique que l'ensemble de la solution est dans la seringue et n'est pas laissé dans l'aiguille de chargement. Sinon, une petite quantité de colorant inerte peut être ajouté à la solution pour le rendre visible.
REMARQUE: Un petit tube de PCR doit être utilisé comme l'aiguille de chargement ne sont généralement pas assez longtemps pour atteindre le fond de la plupart des autres tubes. - Retirer l'aiguille de chargement et le lieu de la seringue sur le bloc seringue d'une pompe seringue, en le fixant avec le dispositif de retenue seringue.
- Insérez doucement l'extrémité du tube connectif dans la seringue; insérez l'autre extrémité dans le support de l'aiguille. Insérez l'aiguille d'injection dans le porte-aiguille. L'extrémité de l'aiguille d'injection doit s'adresser directement à la fin de l'intérieur tube conjonctif de la porte-aiguille.
- Enfoncez lentement le piston pour pousser manuellement la solution à travers le tube conjonctif. Poussez jusqu'à une petite goutte de solution est visible à l'extrémité de l'aiguille d'injection.
- Soigneusement la position du plongeur à côté du bloc poussoir et le fixer en place avec le support de bloc poussoir.
- Réglez les paramètres d'injection: le taux d'injection devrait être d'environ 8μl/min (~ 130nl / s); volume d'injection est généralement de 1-2UL; sélectionner le diamètre seringue appropriée pour la taille de la seringue que vous utilisez (voir le manuel de la pompe seringue pour les directives).
- Réglez le réchaud à ~ 38 ° C et couvrir avec une serviette en papier ou d'autres barrières minces pour protéger les chiots pendant la phase de récupération.
3. Procédure d'injection et de récupération chiot
- Préparer P0 ou P1 souriceaux pour injection, en les soumettant à l'anesthésie à froid suivant un protocole IACUC approuvé. Imbibez un papier essuie quelques avec de l'eau et le placer sur la glace. Placez le nombre désiré de chiots (4-5) sur la serviette en papier (les garder bien séparées) et incorporer délicatement les serviettes en papier sur les chiots afin qu'ils soient couverts par une serviette de papier humide. Placer délicatement une petite quantité de glace pilée sur le dessus de l'essuie-tout et incuber les chiots pendant environ 5 minutes. Les chiots peuvent être conservés sur la glace pendant 15 minutes et récupérer les fines tard.
- Après le chiot est suffisamment anesthésié, placez-le sur un bloc de montage (nous utilisons un bloc de styromousse qui détient normalement 15ml tubes) et la positionner pour obtenir les meilleurs accès au site d'injection. Pour le cortex il est plus facile de poser les plats des animaux sur son ventre, tandis que pour le cervelet, il est utile de positionner la tête de chiot sur le bord du bloc d'offrir un meilleur accès à l'arrière du crâne. Le chiot peut être fixé en place avec un pansement, si désiré.
- Tenez le chiot la tête en place avec une main pendant que l'aiguille est insérée manuellement à travers le crâne à l'endroit désiré avec l'autre main. Il est utile de tirer la peau serré pour l'empêcher de bouger pendant l'injection. Pour le cortex, il est utile de faire les injections par rapport à un repère anatomique bien définis, tels que la suture lambda du crâne, car cela aide à des injections avenir. Le cervelet peut être vu à travers le crâne comme une mince bande de tissu qui se trouve directement à la caudale du colliculus. La profondeur à laquelle l'aiguille doit être introduite varie légèrement entre chaque animal et de souches et peut être mesurée par des marqueurs prédéterminés sur l'aiguille, mais pour le cortex et le cervelet, nous constatons que la profondeur de ~ 0,5 - 1mm de la surface est généralement approprié. La profondeur d'insertion pour d'autres sites devraient être déterminées expérimentalement par l'utilisateur final.
REMARQUE: L'aiguille doit pénétrer facilement dans le crâne, si elle n'a pas, ne poussez pas trop fort car cela peut blesser l'animal. Repositionner l'aiguille et essayez à nouveau délicatement. - Injectez la solution de virus. L'injection est de commencered en appuyant sur la touche START sur la pompe ou déprimante d'une pédale, selon le modèle de la pression de l'injecteur utilisé. En l'absence d'une pédale, il est recommandé d'avoir un collègue aider à appuyer sur le bouton afin de minimiser les mouvements des mains inutiles qui peuvent affecter l'injection.
- Après le volume sélectionné a été injecté, laisser l'aiguille en place pendant quelques secondes puis retirez délicatement l'aiguille en le faisant glisser en douceur. Veillez à tenir le chiot la tête en place pour minimiser les mouvements parasites. Depuis le matériel d'injection est nettoyé et stérilisé entre les expériences avec de l'éthanol et la plaie est petite, l'utilisation d'antiseptiques est inutile.
- Placez le chiot sur la plaque chauffante couverte avec le réglage de la température à ~ 38 ° C pour le réchauffer pour la récupération, à quelques minutes généralement 5-10. Pendant ce temps vous pouvez continuer injectant autres chiots.
- Après tous les chiots ont récupéré (ils doivent être roses et mobiles) de prendre une partie de la maison de la literie et frottez doucement les chiots avec elle. Retour des chiots à la mère en tant que groupe.
REMARQUE: Il est très important de s'assurer que les chiots sont chauds et exposés à la literie à domicile avant de les retourner à la mère et de les retourner en tant que groupe. Ne pas le faire peut entraîner chez la mère de blesser ou tuer les chiots.
4. Nettoyage de l'équipement
- Après l'injection est terminée et les chiots ont été rendus à leur mère, nettoyer l'installation d'injection en mettant pleinement de chargement de la seringue avec de l'acétone ou d'éthanol à 70%. Rincer la solution à travers les temps de réglage d'injection de plusieurs, en utilisant une solution fraîche à chaque fois. Cela permettra d'éliminer toute solution de virus restants et précipités. L'acétone ou l'éthanol sera ensuite s'évaporer.
REMARQUE: L'acétone est préférée pour le nettoyage, mais si votre configuration utilise les composants d'acétone-sensibles, tels que les colles cyanoacrylate, puis d'utiliser l'éthanol à 70% pour ces étapes. - Désinfectez la zone de travail avec les déchets et jetez l'eau de Javel dans un récipient approprié Biohazard.
5. Analyse
- Sacrifice des animaux à l'âge désiré en utilisant une méthode d'euthanasie IACUC approuvé. Fixation de perfusion est recommandée pour faciliter la visualisation ultérieure de neurones infectés, en particulier chez les animaux adultes.
- Procédures immunomarquage standard peut être utilisé pour amplifier le signal fluorescent. Brièvement, 100 um flottante sections vibratome sont perméabilisées avec du PBS 1% de Triton X-100 et bloquée dans du PBS 1% de Triton X-100 de sérum de chèvre normal 10%. Les articles sont incubés dans une solution de blocage avec des anticorps primaires nuit à 4 ° C, suivi par d'autres à laver et de blocage. Les articles sont ensuite incubés dans une solution de blocage avec des anticorps secondaires pendant 2 heures à température ambiante, lavé à fond, monté sur des lames et lamelle avec des anti-décoloration des médias de montage. Cryocoupes peut également être utilisé pour visualiser les neurones marqués, mais la fluorescence endogène pourrait être perdu.
6. Les résultats représentatifs:
Une procédure d'injection va produire une infection réussie robuste de neurones dans la région du site d'injection, sans endommager les tissus observables ou d'autres effets nocifs sur l'animal. Comme l'illustre la figure 1, la propagation de l'infection peut être observé dans Cre-reporter souris (ROSA26R) 12 injectée avec rAAV8-Cre dans des sites anatomiques différents. Les injections dans des régions spécifiques, telles que le cortex et le colliculus supérieur, génèrent habituellement des infections locales à la propagation minimal pour les régions adjacentes (Fig. 1A-B). L'utilisation de solution de titrage de virus élevé rend l'infection des zones adjacentes, telles que l'hippocampe, plus probable (figure 1A). Injection avec des résultats faible titre solution de virus dans l'infection rare, qui reste généralement à proximité du site d'injection, comme indiqué dans l'injection du cervelet rAAV8-Cre sur la ligne médiane de la souris journaliste ROSA26R (figure 1C-D). Nous avons observé la recombinaison chez la souris journaliste ROSA26R dans les 2 jours après l'injection du rAAV8-Cre, ce qui suggère que l'infection, la recombinaison et l'expression de gènes rapporteurs peuvent tous survenir relativement rapidement. En outre, nous avons utilisé avec succès cette technique pour étudier les effets de la délétion du gène à un locus non-ROSA utilisant un allèle floxés conditionnel, dont les résultats seront publiés ailleurs.
Le nombre de cellules infectées devraient en corrélation avec le titre de la solution injectée virale. Par exemple, l'injection d'un mélange de solutions de titre élevé de deux rAAV8 virus exprimant différentes protéines fluorescentes dans le cervelet infecte de nombreuses cellules de Purkinje qui sont étiquetés différemment (figure 2A). Inversement, l'injection d'une solution de faible titre de virus peut entraîner une infection rare pour aider à visualiser des cellules individuelles (figure 2B). Neurones marqués par fluorescence peut être observée directement dans fraîches coupées, les tissus vivants (figure 2B) ou peuvent être soumis à immunomarquage pour améliorer les signaux fluorescents endogènes d'acquisition d'images plus tard, par grand champ ou confocal microscopie à fluorescence (Fig. 2A, Fig. 3A-C). Enfin, rAAV8 est capable d'infecter une variété de types de neurones dans le cortex de l'étiquetage des processus solides fines (Fig. 3A-C).
Figure 1: coloration LacZ dans le cerveau de souris journaliste ROSA26R qui ont été injectés avec rAAV8-Cre au P0 a démontré une activité Cre et la localisation de l'infection.
- Large champ vue sagittale d'un cerveau P14 montrant un titre élevé (1x10 12 GC / ml) dans le cortex et les injections colliculus supérieur. L'utilisation de virus de titre élevé rend plus probable que les zones adjacentes seront également infectés.
- Coupe sagittale de P14 cortex injecté à faible titre (1x10 11 GC / ml) du virus montre une infection locale avec moins de se propager.
- Une vue d'un cervelet wholemount P28 injecté à la ligne médiane avec un faible titre (1x10 9 GC / ml) solution de virus montre que l'infection est rare et reste généralement à proximité du site d'injection.
- Vue sagittale de la ligne médiane du cervelet dans C). Notez que généralement que les cellules de Purkinje sont infectés par rAAV8.
Figure 2: étiquetage cérébelleuse par injection avec des titres élevés et faibles de rAAV8 exprimer des protéines fluorescentes.
- Une coupe sagittale de P21cerebellum infectées avec un mélange de deux virus exprimant l'EGFP (vert) et DsRed (rouge). Un mix titre élevé de virus a été utilisé pour infecter un grand nombre de cellules de Purkinje.
- Une cellule de Purkinje du cervelet en direct P14 de l'infection virale très faible titre imagé immédiatement après la dissection.
Figure 3: étiquetage corticale par rAAV8-DsRed.
Des exemples de la variété des types de neurones corticaux dans les coupes coronales d'un cortex P21 qui a été infecté par rAAV8-DsRed au P0.
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Discussion
La méthode d'injection néonatale virale présenté ici offre un moyen simple et rapide de générer des mosaïques in vivo pour l'étude du développement du cerveau postnatal. La méthode tire parti des allèles floxés qui sont actuellement disponibles ainsi que ceux qui sont faits par le gène High Throughput ciblage des projets 6. Comparé à l'utilisation de l'expression transgénique de la CRE, cette méthode fournit un moyen rapide de tester la fonction des gènes dans différents types cellulaires, comme des souris porteuses d'allèles floxés peut être utilisé directement pour des expériences, et la procédure d'injection virus entier du début à la finition peut être accompli en moins d'une heure. En outre, le nombre de cellules infectées peut être facilement contrôlé en modifiant le titre du virus, ce qui permet l'étiquetage des rares neurones individuels. Bien que nous ne décrit la morphologie neuronale dans les images de l'échantillon, l'analyse des neurones infectés peut être étendu à de nombreux processus importants de développement, y compris la croissance axonale et dendritique, la ramification et le carrelage, ainsi que le développement synaptique tels que la morphogenèse du rachis.
Les trois parties les plus critiques de la procédure sont la précision du ciblage au site d'injection, la fiabilité du matériel d'injection, et la survie des chiots. Le premier aspect - la précision - est préférable d'apprendre par l'expérience. La fiabilité du matériel d'injection se réfère au fait que l'on doit s'assurer qu'il n'y ait pas de sabots, des fuites, ou d'autres problèmes avec le matériel avant l'injection. Enfin, la survie des chiots n'est généralement pas un problème si les conseils mentionnés à l'étape 3.7 sont respectées.
Une modification évidente de cette procédure est d'utiliser un mélange de virus exprimant des gènes différents. Par exemple, un mélange de deux virus, rAAV-Cre-GFP et rAAV-DP, peut être injecté pour produire une mosaïque de KO clairsemée étiquetés (vert) et de contrôle (rouge) des cellules dans un seul animal. Cela donne un net avantage sur KO génétique traditionnelle pour l'analyse des cellules individuelles, ce qui rend particulièrement utile pour l'analyse morphologique des neurones de type sauvage ou allèles mutants dans le cerveau de souris mêmes. Cela peut aussi être une limitation, toutefois, si l'on souhaite effectuer des études comportementales, dans lesquelles il peut être nécessaire de manipuler un grand nombre de neurones pour produire un effet observable. Nous constatons que nous pouvons généralement des injections jusqu'à l'âge post-natal 3 (P3), mais dès l'âge de P4 et sur le crâne est souvent trop épais facilement ponction avec l'aiguille d'injection. L'épaisseur du crâne à un âge particulier peut varier d'un animal à, cependant, si cette question doit être évaluée par l'expérimentateur.
En plus d'utiliser des protéines fluorescentes a exprimé de la Cre-exprimant le virus, de nombreuses souris rapporteur fluorescent avec les allèles loxP-STOP-loxP ont été générés 13 et peut être incorporé à l'allèle floxés. Bien que l'inclusion du nouvel allèle ajoute le temps nécessaire pour l'obtention des souris avec des génotypes appropriés, ces souris journaliste peut simultanément surveiller l'activité des neurones individuels Cre et l'étiquette.
En raison de la tropisme sélectif des rAAVs recombinantes, différents types de cellules neuronales peuvent être étiquetés dans les régions anatomiques en choisissant un sérotype particulier rAAV (figure 1D). La spécificité peut aussi être obtenu en utilisant différents promoteurs. En outre, d'autres virus, tels que des lentivirus, peut être utilisé pour infecter les neurones 10. L'avantage ici est que ces virus peuvent transporter inserts d'ADN plus d'exprimer non seulement Cre mais aussi d'autres matériaux génétiques, telles que shRNA et dominant les gènes actifs. Par ailleurs, la méthode peut être également utilisé chez les rats transgéniques nouvellement développé 14, où conditionnellement exprimé lignes CRE ne sont pas bien établies. Enfin, une fois cette technique est établi dans le laboratoire, il peut être combiné avec d'autres outils analytiques, tels que in vivo à deux photons d'imagerie 11 et / ou l'électrophysiologie, pour étudier la fonction de chaque gène dans le développement des circuits neuronaux et la fonction.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail est soutenu par une subvention du NIH RO1 (NINDS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| rAAV8-Cre, -GFP, -DsRed, | Vector Biolabs | #7060, #7061, custom order | http://www.vectorbiolabs.com |
| Harvard Pump 11 Plus | Harvard Apparatus | #702208 | (No foot pedal port) |
| Retinal Pigment Epithelium Injection Kit | World Precision Instruments, Inc. | RPE-KIT | Contains connective tubing, injection needles (36G), and needle holder |
| NanoFil Syringe, 100μl | World Precision Instruments, Inc. | NANOFIL-100 | Includes reusable loading needle |
| D-PBS | Invitrogen | 14040-117 | |
| GFP antibody | Aves | GFP-1020 | |
| DsRed antibody | Clontech Laboratories | 632496 | |
| Heating Block | VWR international | 97042-610 | |
| ROSA26R mouse | Jackson Laboratory | 003309 |
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