Summary

ウイルスベースのCre組換えによる出生後のマウスの脳の発達における遺伝子機能のモザイク解析

Published: August 01, 2011
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Summary

アン<em> in vivoで</em出生後の脳における遺伝子機能をテストする>方法が記載されている。 CREおよび/または蛍光タンパク質を発現する組換えAAVsは、新生児マウスの脳に注入されています。モザイク遺伝子の不活性化とスパース神経ラベリングは神経回路の発達に重要なプロセスで遺伝子機能の迅速な分析を可能にする、達成されています。

Abstract

神経回路が成熟し、洗練されているときに正常な脳の機能は、生後発達にだけでなく、主要な神経経路が確立されている胚発生に依存していますが、。この段階での制御ミスは、自閉症や統合失調症の1,2などの神経および精神疾患につながる可能性があります。多くの遺伝子は出生前の脳で勉強し、多くの発達過程3-5重要な発見されている。しかし、出生後の脳におけるそれらの機能は、マウスでそれらの欠失はしばしば新生児の開発中に致死性につながることもあり、あまり知られていない、と開発の初期段階でそれらの要件は、出生後の分析を阻害する一因。これらの障害を克服するために、これらの遺伝子のfloxed対立遺伝子は、現在マウス6で生成されています。するときは、特定の細胞型で発現するCreリコンビナーゼ、条件付きの削除は生後脳における遺伝子機能を研究するために達成することができることをトランスジェニック対立遺伝子と組み合わせる。しかし、この方法では、それによってマウスの脳内で大規模に遺伝子解析の拡大を制限し、追加の対立遺伝子と適切な遺伝子型を有するマウスを作製するために余分な時間(3〜6ヵ月)が必要です。

ここでは、生後脳の発達で急速にかつ体系的にこれらのfloxed対立遺伝子を研究するためにウイルスにより発現するCreを使用して補完的なアプローチを示しています。新生児の脳の中に組換えアデノ随伴ウイルス(rAAVs)7,8エンコーディングCreを注入することにより、我々は脳の異なる領域に目的の遺伝子を削除することができます。ウイルス力価を制御し、蛍光タンパク質マーカーを共発現することにより、我々は同時にモザイクの遺伝子の不活性化とスパース神経ラベリングを実現することができます。このメソッドは、分岐、およびタイルだけでなく、シナプス形成と洗練された、開発の初期段階で多くの遺伝子の要件をバイパスし、私たちは軸索と樹状突起の成長を含む生後脳の発達の多くの重要なプロセスでそれらの細胞自律的な機能を、勉強することができます。このメソッドは、我々自身の研究室(未発表の結果)など8,9で正常に使用されており、このようなレンチウイルス9など他のウイルス、、するだけでなく、shRNAまたは支配的に活性なタンパク質10の表現に拡張することができます。さらに、電気生理学でこのテクニックを組み合わせるだけでなく、最近開発した光イメージングツール11で、この方法では、遺伝的経路はマウスとラットにおける神経回路の発達と機能にどのように影響するかを研究する新たな戦略を提供します。

Protocol

1。注射の準備ウィルス rAAVsは推奨商用ベンダーから購入したが、彼らはまた、(下の説明を参照)自分の研究室で製造することができる。ウイルス溶液は、typicallyミリリットル当たり〜1 × 10 12ゲノムコピー(GC / ml)の力価で産生され、多数のセルを操作する完全な力価で使用することができる。また、彼らは疎ラベリングの必要なレベルを生成するために希釈することがで…

Discussion

ここで紹介する新生児のウイルスの注射法では、生後脳の発達の研究のための生体モザイク生成するための簡単かつ迅速な方法を提供します。方法は、プロジェクト6をターゲット高スループットの遺伝子を介して行われているものとしてだけでなく、現在利用可能なfloxed対立遺伝子を利用しています。のCreのトランスジェニック発現の使用に比べて、この?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、NIH(NINDS)からRO1助成金によってサポートされています。

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
rAAV8-Cre, -GFP, -DsRed, Vector Biolabs #7060, #7061, custom order http://www.vectorbiolabs.com
Harvard Pump 11 Plus Harvard Apparatus #702208 (No foot pedal port)
Retinal Pigment Epithelium Injection Kit World Precision Instruments RPE-KIT Contains connective tubing, injection needles (36G), and needle holder
NanoFil Syringe, 100μl World Precision Instruments NANOFIL-100 Includes reusable loading needle
D-PBS Invitrogen 14040-117  
GFP antibody Aves GFP-1020  
DsRed antibody Clontech 632496  
Heating Block VWR 97042-610  
ROSA26R mouse Jackson Laboratory 003309  

References

  1. Geschwind, D. H., Levitt, P. Autism spectrum disorders: developmental disconnection syndromes. Curr Opin Neurobiol. 17, 103-111 (2007).
  2. Giedd, J. N., Rapoport, J. L. Structural MRI of pediatric brain development: what have we learned and where are we going?. Neuron. 67, 728-734 (2010).
  3. Chedotal, A., Richards, L. J. Wiring the brain: the biology of neuronal guidance. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).
  4. Shen, K., Cowan, C. W. Guidance molecules in synapse formation and plasticity. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).
  5. Chen, S. Y., Cheng, H. J. Functions of axon guidance molecules in synapse formation. Curr Opin Neurobiol. 19, 471-478 (2009).
  6. Guan, C., Ye, C., Yang, X., Gao, J. A review of current large-scale mouse knockout efforts. Genesis. 48, 73-85 (2010).
  7. Tenenbaum, L. Recombinant AAV-mediated gene delivery to the central nervous system. J Gene Med. 6, 212-222 (2004).
  8. Broekman, M. L., Comer, L. A., Hyman, B. T., Sena-Esteves, M. Adeno-associated virus vectors serotyped with AAV8 capsid are more efficient than AAV-1 or -2 serotypes for widespread gene delivery to the neonatal mouse brain. Neuroscience. 138, 501-510 (2006).
  9. Pilpel, N., Landeck, N., Klugmann, M., Seeburg, P. H., Schwarz, M. K. Rapid reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain. J Neurosci Methods. 182, 55-63 (2009).
  10. Szulc, J., Aebischer, P. Conditional gene expression and knockdown using lentivirus vectors encoding shRNA. Methods Mol Biol. 434, 291-309 (2008).
  11. Pan, F., Gan, W. B. Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex. Dev Neurobiol. 68, 771-778 (2008).
  12. Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21, 70-701 (1999).
  13. Madisen, L. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13, 133-1340 (2010).
  14. Tong, C., Li, P., Wu, N. L., Yan, Y., Ying, Q. L. Production of p53 gene knockout rats by homologous recombination in embryonic stem cells. Nature. 467, 211-213 (2010).

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Cite This Article
Gibson, D. A., Ma, L. Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination. J. Vis. Exp. (54), e2823, doi:10.3791/2823 (2011).

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