Summary

Мозаика Анализ функции генов в постнатальном развитии мозга мыши с помощью вирусов основан Cre Рекомбинация

Published: August 01, 2011
doi:

Summary

<em> В естественных условиях</em> Метод для тестирования функции генов в послеродовом мозга описывается. Рекомбинантный AAVs выражения Cre и / или флуоресцентного белка вводят в мозг новорожденных мышей. Мозаика инактивации гена и редкие нейронов маркировки будут достигнуты, позволяя быстрый анализ функции генов в процессах решающее значение для развития нервной цепи.

Abstract

Нормальное функционирование мозга зависит не только от эмбрионального развития, когда основные нейронные пути установлены, но также и от послеродового развития, когда нейронные цепи выдерживаются и изысканной. Misregulation на данном этапе может привести к неврологических и психиатрических расстройств, таких, как аутизм и шизофрения 1,2. Многие гены были изучены в пренатальный мозг и обнаружил, решающее значение для многих процессов развития 3-5. Тем не менее, их функции в послеродовом мозга в значительной степени неизвестны, отчасти потому, что их удаление у мышей часто приводит к летальности в течение неонатального развития, а отчасти потому, что их требования в раннем развитии препятствует послеродовой анализа. Чтобы преодолеть эти препятствия, floxed аллелей этих генов в настоящее время генерируется у мышей 6. В сочетании с трансгенными аллелей, которые выражают Cre рекомбиназы в специфические типы клеток, условное исключение может быть достигнуто для изучения функции генов в послеродовом мозга. Однако этот метод требует дополнительных аллелей и дополнительное время (3-6 месяцев) для создания мышей с соответствующими генотипов, тем самым ограничивая расширение генетического анализа больших масштабах в мозге мыши.

Здесь мы показываем, дополнительный подход, использующий вирусно-выразил Cre для изучения этих аллелей floxed быстро и систематически в постнатальном развитии мозга. Вводя рекомбинантный адено-ассоциированные вирусы (rAAVs) 7,8 кодирования Cre в неонатального мозга, мы можем удалить интересующего гена в различных регионах мозга. Контролируя вирусного титра и coexpressing флуоресцентного маркера белка, мы можем одновременно достичь мозаики инактивации гена и редкие нейронов маркировки. Этот метод позволяет обойти требование многих генов в раннем развитии, а также позволяет изучать их клеточной автономной функции во многих важных процессов в постнатальном развитии мозга, в том числе аксонального и дендритные рост, ветвление и плитки, а также формирование синапса и утонченности. Этот метод успешно применяется в нашей лаборатории (неопубликованные результаты), а другие 8,9, и может быть распространен и на другие вирусы, такие как лентивирус 9, а также выражение shRNA или доминирующим активных белков 10. Кроме того, объединив эту технику с электрофизиологии, а также недавно разработанные оптические инструменты визуализации 11, этот метод обеспечивает новую стратегию чтобы изучить, как генетические пути влияния развития нервной цепи и функции у мышей и крыс.

Protocol

1. Подготовка вирусов для инъекций rAAVs были приобретены у коммерческих поставщиков рекомендуется, но они также могут быть произведены в собственной лаборатории (см. ниже). Вирус решение, как правило, производится на титр ~ 1×10 12 геном копий на миллилитр (GC / мл) и может быть испол…

Discussion

Новорожденных вирусный метод инъекции, представленные здесь обеспечивает простой и быстрый способ создания в естественных условиях мозаика для изучения постнатального развития мозга. Метод использует floxed аллели, которые в настоящее время, а также те, которые делаются в рамках Г?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа проводится при поддержке RO1 грант NIH (NINDS).

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
rAAV8-Cre, -GFP, -DsRed, Vector Biolabs #7060, #7061, custom order http://www.vectorbiolabs.com
Harvard Pump 11 Plus Harvard Apparatus #702208 (No foot pedal port)
Retinal Pigment Epithelium Injection Kit World Precision Instruments RPE-KIT Contains connective tubing, injection needles (36G), and needle holder
NanoFil Syringe, 100μl World Precision Instruments NANOFIL-100 Includes reusable loading needle
D-PBS Invitrogen 14040-117  
GFP antibody Aves GFP-1020  
DsRed antibody Clontech 632496  
Heating Block VWR 97042-610  
ROSA26R mouse Jackson Laboratory 003309  

References

  1. Geschwind, D. H., Levitt, P. Autism spectrum disorders: developmental disconnection syndromes. Curr Opin Neurobiol. 17, 103-111 (2007).
  2. Giedd, J. N., Rapoport, J. L. Structural MRI of pediatric brain development: what have we learned and where are we going?. Neuron. 67, 728-734 (2010).
  3. Chedotal, A., Richards, L. J. Wiring the brain: the biology of neuronal guidance. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).
  4. Shen, K., Cowan, C. W. Guidance molecules in synapse formation and plasticity. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).
  5. Chen, S. Y., Cheng, H. J. Functions of axon guidance molecules in synapse formation. Curr Opin Neurobiol. 19, 471-478 (2009).
  6. Guan, C., Ye, C., Yang, X., Gao, J. A review of current large-scale mouse knockout efforts. Genesis. 48, 73-85 (2010).
  7. Tenenbaum, L. Recombinant AAV-mediated gene delivery to the central nervous system. J Gene Med. 6, 212-222 (2004).
  8. Broekman, M. L., Comer, L. A., Hyman, B. T., Sena-Esteves, M. Adeno-associated virus vectors serotyped with AAV8 capsid are more efficient than AAV-1 or -2 serotypes for widespread gene delivery to the neonatal mouse brain. Neuroscience. 138, 501-510 (2006).
  9. Pilpel, N., Landeck, N., Klugmann, M., Seeburg, P. H., Schwarz, M. K. Rapid reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain. J Neurosci Methods. 182, 55-63 (2009).
  10. Szulc, J., Aebischer, P. Conditional gene expression and knockdown using lentivirus vectors encoding shRNA. Methods Mol Biol. 434, 291-309 (2008).
  11. Pan, F., Gan, W. B. Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex. Dev Neurobiol. 68, 771-778 (2008).
  12. Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21, 70-701 (1999).
  13. Madisen, L. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13, 133-1340 (2010).
  14. Tong, C., Li, P., Wu, N. L., Yan, Y., Ying, Q. L. Production of p53 gene knockout rats by homologous recombination in embryonic stem cells. Nature. 467, 211-213 (2010).

Play Video

Cite This Article
Gibson, D. A., Ma, L. Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination. J. Vis. Exp. (54), e2823, doi:10.3791/2823 (2011).

View Video