Мозаика Анализ функции генов в постнатальном развитии мозга мыши с помощью вирусов основан Cre Рекомбинация
Summary
<em> В естественных условиях</em> Метод для тестирования функции генов в послеродовом мозга описывается. Рекомбинантный AAVs выражения Cre и / или флуоресцентного белка вводят в мозг новорожденных мышей. Мозаика инактивации гена и редкие нейронов маркировки будут достигнуты, позволяя быстрый анализ функции генов в процессах решающее значение для развития нервной цепи.
Abstract
Нормальное функционирование мозга зависит не только от эмбрионального развития, когда основные нейронные пути установлены, но также и от послеродового развития, когда нейронные цепи выдерживаются и изысканной. Misregulation на данном этапе может привести к неврологических и психиатрических расстройств, таких, как аутизм и шизофрения 1,2. Многие гены были изучены в пренатальный мозг и обнаружил, решающее значение для многих процессов развития 3-5. Тем не менее, их функции в послеродовом мозга в значительной степени неизвестны, отчасти потому, что их удаление у мышей часто приводит к летальности в течение неонатального развития, а отчасти потому, что их требования в раннем развитии препятствует послеродовой анализа. Чтобы преодолеть эти препятствия, floxed аллелей этих генов в настоящее время генерируется у мышей 6. В сочетании с трансгенными аллелей, которые выражают Cre рекомбиназы в специфические типы клеток, условное исключение может быть достигнуто для изучения функции генов в послеродовом мозга. Однако этот метод требует дополнительных аллелей и дополнительное время (3-6 месяцев) для создания мышей с соответствующими генотипов, тем самым ограничивая расширение генетического анализа больших масштабах в мозге мыши.
Здесь мы показываем, дополнительный подход, использующий вирусно-выразил Cre для изучения этих аллелей floxed быстро и систематически в постнатальном развитии мозга. Вводя рекомбинантный адено-ассоциированные вирусы (rAAVs) 7,8 кодирования Cre в неонатального мозга, мы можем удалить интересующего гена в различных регионах мозга. Контролируя вирусного титра и coexpressing флуоресцентного маркера белка, мы можем одновременно достичь мозаики инактивации гена и редкие нейронов маркировки. Этот метод позволяет обойти требование многих генов в раннем развитии, а также позволяет изучать их клеточной автономной функции во многих важных процессов в постнатальном развитии мозга, в том числе аксонального и дендритные рост, ветвление и плитки, а также формирование синапса и утонченности. Этот метод успешно применяется в нашей лаборатории (неопубликованные результаты), а другие 8,9, и может быть распространен и на другие вирусы, такие как лентивирус 9, а также выражение shRNA или доминирующим активных белков 10. Кроме того, объединив эту технику с электрофизиологии, а также недавно разработанные оптические инструменты визуализации 11, этот метод обеспечивает новую стратегию чтобы изучить, как генетические пути влияния развития нервной цепи и функции у мышей и крыс.
Protocol
Discussion
Новорожденных вирусный метод инъекции, представленные здесь обеспечивает простой и быстрый способ создания в естественных условиях мозаика для изучения постнатального развития мозга. Метод использует floxed аллели, которые в настоящее время, а также те, которые делаются в рамках Г?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа проводится при поддержке RO1 грант NIH (NINDS).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| rAAV8-Cre, -GFP, -DsRed, | Vector Biolabs | #7060, #7061, custom order | http://www.vectorbiolabs.com |
| Harvard Pump 11 Plus | Harvard Apparatus | #702208 | (No foot pedal port) |
| Retinal Pigment Epithelium Injection Kit | World Precision Instruments | RPE-KIT | Contains connective tubing, injection needles (36G), and needle holder |
| NanoFil Syringe, 100μl | World Precision Instruments | NANOFIL-100 | Includes reusable loading needle |
| D-PBS | Invitrogen | 14040-117 | |
| GFP antibody | Aves | GFP-1020 | |
| DsRed antibody | Clontech | 632496 | |
| Heating Block | VWR | 97042-610 | |
| ROSA26R mouse | Jackson Laboratory | 003309 |
References
- Geschwind, D. H., Levitt, P. Autism spectrum disorders: developmental disconnection syndromes. Curr Opin Neurobiol. 17, 103-111 (2007).
- Giedd, J. N., Rapoport, J. L. Structural MRI of pediatric brain development: what have we learned and where are we going?. Neuron. 67, 728-734 (2010).
- Chedotal, A., Richards, L. J. Wiring the brain: the biology of neuronal guidance. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).
- Shen, K., Cowan, C. W. Guidance molecules in synapse formation and plasticity. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).
- Chen, S. Y., Cheng, H. J. Functions of axon guidance molecules in synapse formation. Curr Opin Neurobiol. 19, 471-478 (2009).
- Guan, C., Ye, C., Yang, X., Gao, J. A review of current large-scale mouse knockout efforts. Genesis. 48, 73-85 (2010).
- Tenenbaum, L. Recombinant AAV-mediated gene delivery to the central nervous system. J Gene Med. 6, 212-222 (2004).
- Broekman, M. L., Comer, L. A., Hyman, B. T., Sena-Esteves, M. Adeno-associated virus vectors serotyped with AAV8 capsid are more efficient than AAV-1 or -2 serotypes for widespread gene delivery to the neonatal mouse brain. Neuroscience. 138, 501-510 (2006).
- Pilpel, N., Landeck, N., Klugmann, M., Seeburg, P. H., Schwarz, M. K. Rapid reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain. J Neurosci Methods. 182, 55-63 (2009).
- Szulc, J., Aebischer, P. Conditional gene expression and knockdown using lentivirus vectors encoding shRNA. Methods Mol Biol. 434, 291-309 (2008).
- Pan, F., Gan, W. B. Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex. Dev Neurobiol. 68, 771-778 (2008).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21, 70-701 (1999).
- Madisen, L. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13, 133-1340 (2010).
- Tong, C., Li, P., Wu, N. L., Yan, Y., Ying, Q. L. Production of p53 gene knockout rats by homologous recombination in embryonic stem cells. Nature. 467, 211-213 (2010).
