Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Metodo di particelle agglutinazione per l'identificazione Poliovirus

doi: 10.3791/2824 Published: April 20, 2011

Summary

Un recente sviluppo di particelle romanzo agglutinazione (PA) test utilizzando molecola recettore del virus ha permesso l'identificazione rapida e facile dei poliovirus (PV). In questo articolo mostreremo la procedura per il saggio PA per l'identificazione fotovoltaico.

Abstract

Nel Global Polio Eradication Initiative, diagnosi di laboratorio svolge un ruolo critico, isolando e identificando PV dai campioni di feci di paralisi flaccida acuta (AFP) casi. Nel Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) Global Polio Laboratory Network, PV isolamento e l'identificazione sono attualmente in corso, utilizzando la cultura sistema di celle e real-time RT-PCR, rispettivamente. Nell'era post-eradicazione era del fotovoltaico, procedure di identificazione semplice e rapida sarebbe utile per una rapida conferma di casi di polio presso i laboratori nazionali. Nel presente studio, mostreremo la procedura di test romanzo PA sviluppato per l'identificazione fotovoltaico. Questo test PA utilizza l'interazione del recettore PV (PVR) e virione molecola che è specifica affinità e uniforme a tutti i sierotipi del fotovoltaico. La procedura è semplice (una procedura passo in lastre di reazione) e rapido (risultati possono essere ottenuti entro 2 h di reazione), e il risultato è visivamente osservato (osservazione di agglutinazione di particelle di gelatina).

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Preparazione del terreno di mantenimento (MM) e una crescita media (GM)

Per la preparazione di MM e GM, consultare un manuale Polio laboratorio dell'OMS 1. Medio Dulbecco modificato Eagle (DMEM) arricchito con il 2% di siero fetale bovino (FCS) e il 10% di FCS potrebbero essere utilizzati come sostituti di MM e GM, rispettivamente.

2. Preparazione di anticorpi anti-PV

  1. Ricostituire anticorpi anti-PV (PV RIVM digitando antisiero) con l'aggiunta di acqua (0,5 ml per flaconcino) per ogni flaconcino di anticorpi anti-PV (tipo 1, 2 o 3). Aggiungi questo anticorpo soluzioni ricostituite (0,5 ml ciascuno) a 4,5 ml di MM in tubi separati etichettati.
    Nota: alcuni lotti di anticorpi anti-PV sono forniti come forma ricostituito (0,5 ml per flaconcino). Per il lotto di tali anticorpi anti-PV, aggiunta di acqua per la ricostituzione non è necessaria.
  2. Mescolare uguale volume di ricostituito anticorpi anti-PV. Per anti-PV1 +2, 2 +3 o 3 +1: Mescolare 1,8 ml di ciascun anticorpo ricostituito (1,8 ml + 1,8 ml = 3,6 mL per ciascuna miscela). Per anti-PV1 +2 +3: Mescolare 1,2 ml di ciascun anticorpo ricostituito (1,2 ml + 1,2 ml + 1,2 ml = 3,6 mL).
    Nota: i campioni PV potrebbe contenere una miscela di diversi sierotipi del fotovoltaico. Per identificare il sierotipo singolo del fotovoltaico in campioni con miscela di PV, pool di anticorpi anti-PV (cioè 1 +2, 2 +3, 3 +1, 1 +2 +3) è necessario.
  3. Aggiungere il volume 1 / 5 di FCS (0,72 ml) per ogni anti-PV (1 +2, 2 +3, 3 +1 o 1 +2 +3) anticorpi (3,6 mL) (finale 18,2% FCS).
    Nota: L'aggiunta di FCS sia per la riduzione della non-specifici agglutinazione di particelle di gelatina causata da anticorpi.
  4. Mantenere le piscine degli anticorpi a -20 ° C fino all'utilizzo nei test PA.

3. Ricostituzione di gelatina sensibilizzata particelle

  1. Aggiungere 1,5 mL di tampone ricostituzione inclusi nel kit di un flaconcino di particelle di gelatina sensibilizzata (fornito come polvere liofilizzata).
  2. Mescolare bene picchiettando leggermente
  3. Mantenere la particella ricostituito sensibilizzato a 4 ° C. Ricostituito particelle gelatina potrebbe essere attiva almeno 2 settimane a 4 ° C, ma deve essere preparato poco prima del test.

Nota importante:
Non mescolare molto diverso di particelle di gelatina sensibilizzata, perché il non-agglutinazione immagine di particelle di gelatina sensibilizzata potrebbe essere diverso dal lotto delle particelle. Per ogni esperimento, un singolo lotto di gelatina sensibilizzata particella dovrebbe essere usato.

4. PA test per l'identificazione PV

  1. Preparare una micro-titolazione piatto. Per l'identificazione di un campione di virus, abbiamo bisogno di 5 pozzi + almeno un controllo negativo (particelle sensibilizzati senza virus e anticorpi, ben n. 6 di seguito. See No controllo del virus e anticorpi in esempio). Numero totale dei pozzi è di 5 x campioni + almeno un controllo nel saggio.
    Nota importante:
    Si prega di prendere almeno un non controllo del virus e anticorpi nel saggio. Un flaconcino di particelle sensibilizzati circa l'identificazione di 10 campioni del virus.
  2. Aggiungere 12 microlitri / pozzetto di anticorpi anti-PV o GM al micro-titolazione piatto. La disposizione del piatto è la seguente (Vedi anche Esempio di seguito). Nei campioni senza anticorpi (camera n. 1 e 6), aggiungere 12 ml di GM invece di anticorpi anti-PV.
    Nota importante:
    Se molti campioni PV dovrebbero essere testati in questo saggio, pipetta multicanale o distributore sarebbe utile per questo passo.
    Bene # 1 Bene # 2 Bene # 3 Bene # 4 Bene # 5 Bene # 6
    GM anti-P1 +2 +3 anti-P1 2 anti-P2 3 ani-P1 3 GM
  3. Aggiungere 12 microlitri / pozzetto di campione virus. In un campione senza virus (o meglio # 6), aggiungere 12 ml di GM al posto della soluzione di virus.
    Nota: campione di virus è supernatante della coltura delle cellule infettate, le cellule di solito L20B o cellule RD.
    Nota importante:
    Se molti campioni PV dovrebbero essere testati in questo saggio, pipetta multicanale sarebbe utile per questo passo.
    Bene # 1 Bene # 2 Bene # 3 Bene # 4 Bene # 5 Bene # 6
    virus campione virus campione virus campione virus campione virus campione GM
  4. Prendere soluzione ricostituita sensibilizzati particelle da 4 ° C a temperatura ambiente, e picchiettare delicatamente di sospendere completamente le particelle.
    Nota importante:
    Dopo la sospensione completa delle particelle picchiettando leggermente, le particelle dovrebbero essere aggiunti immediatamente ai piatti prima della particelle sospese precipitazionite e la forma non omogenea soluzione.
  5. Aggiungere 25 microlitri / pozzetto di particelle sensibilizzati a tutti i pozzetti.
    Nota importante:
    Dopo l'aggiunta di particelle sensibilizzate, la piastra deve essere immediatamente sottoposto a piastra di miscelazione per iniziare la reazione uniforme dei campioni. Pertanto, l'aggiunta di particelle sensibili deve essere effettuata utilizzando dosatore per minimizzare un intervallo di tempo tra i campioni nel piatto.
  6. Mettere il micro-titolazione piastra su un piatto e mixer miscelare la piastra per 30 sec.
  7. Mettere il micro-titolazione piastra su carta bianca (per comodità di osservazione visuale) su un tavolo a temperatura ambiente (15 ~ 30 ° C) per 2 ore
    Nota importante:
    Non spostare la piastra durante e dopo la reazione per l'osservazione dei risultati e fotografare. L'agglutinazione formato non è stabile e facilmente disturbati dal movimento delle piastre.
  8. Scatta foto del piatto.
    Nota importante:
    Veduta parziale della foto non poteva dare dati sufficienti per il successivo esame e la revisione dei risultati per l'interpretazione. Diverse foto dovrebbe essere preso per coprire tutti i pozzetti delle piastre di messa a fuoco l'immagine agglutinazione dei pozzi.

5. Interpretazione dei risultati

  1. L'identificazione dei pozzetti positivi e negativi. Confrontare le agglutinazione nei campioni con quella di nessun controllo dei virus e degli anticorpi (precipitazione di particelle di gelatina, non agglutinazione) (Figura 1 e 2). Immagini di agglutinazione che sono chiaramente distinti dalle Nessun virus e nessun controllo di anticorpi (non agglutinazione, controllo negativo) dovrebbe essere giudicata positivamente, e le immagini di agglutinazione che sono simili al controllo negativo deve essere giudicato negativo. I campioni che mostrano agglutinazione evidente, ma solo parziale potrebbe essere giudicata positivamente, ma record come 'positivo (agglutinazione parziale)'.
  2. Identificazione del fotovoltaico. Interpretare i risultati sulla base di pozzetti positivi e negativi con anticorpi anti-PV per identificare i sierotipi fotovoltaico. Principio della interpretazione del risultato è simile a quella del test di neutralizzazione del sistema di coltura cellulare (ad esempio positivo per anti-P1 due anticorpi indica che il campione contiene tipo 3 PV).

6. Rappresentante Risultati

Risultato rappresentativo della PA test PV identificazione è mostrata in Figura 1. Tutti i ceppi PV formata agglutinazione di particelle di gelatina sensibilizzata (senza anticorpi campioni). In presenza di corrispondenti anticorpi anti-PV, la precipitazione di particelle di gelatina (non-agglutinazione) simile a No virus e nessun controllo di anticorpi (controllo negativo) è stato osservato (ad esempio, PV1 (Sabin) in presenza di anti-P1 +2 o anti-P3 1 anticorpi).

Figura 1
Figura 1. Le soluzioni antivirus identificazione del fotovoltaico mediante test PA. Di PV1 (Sabin), PV2 (Sabin), e PV3 (Sabin) (titoli virus di 1,2 x 10 8 CCID 50 / 12 microlitri, 8,2 x 10 7 CCID 50 / 12 microlitri, e 3,5 x 10 7 CCID 50 / 12 microlitri, rispettivamente) sono stati utilizzati per l'identificazione mediante test PA. Nessun virus e nessun controllo di anticorpi hanno mostrato precipitazione di particelle di gelatina (non-agglutinazione, controllo negativo).

Figura 2
Figura 2. Interpretazione dei pozzi positivi e negativi. Soluzioni antivirus di PV1 (Sabin), PV2 (Sabin), e PV3 (Sabin) (titoli virus di 2,4 x 10 8 CCID 50 / 25 microlitri, 1,7 x 10 8 CCID 50 / 25 microlitri, e 7,3 x 10 7 CCID 50 / 25 microlitri, rispettivamente) sono stati diluiti 1 / 20 a 1 / 320, e poi 25 ml di campioni diluiti sono stati esaminati mediante test PA senza anti-PV anticorpi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

L'unico punto di questo test PA è l'utilizzo della molecola PVR invece di anticorpi anti-PV per il rilevamento di PV 2. Questo consente una specifica interazione delle particelle di gelatina sensibilizzata con PV con una affinità uniforme per tutti e tre i sierotipi di PV 3-6. Abbiamo usato una forma immunoadhesin di PVR (PVR-IgG2a) per la sensibilizzazione delle particelle di gelatina, in quanto forme monomeriche di PVR hanno solo affinità moderata al singolo sito vincolanti per le virione (costante di dissociazione di 10 -7 ~ -8 M) 7, 8, e con successo osservato agglutinazione specifica delle particelle di gelatina sensibilizzata con isolati fotovoltaico. Con l'alta specificità e affinità uniforme delle particelle sensibilizzate, i fattori critici di identificazione fotovoltaico nel saggio PA sono: 1) virus titolo (per la rilevazione valida fotovoltaico da PA test) e 2) l'interpretazione di agglutinazione (per l'identificazione corretta di PV) .

In generale, virus titolo del fotovoltaico isola nel sistema di coltura cellulare è in una gamma di 06-8 ottobre DITC 50 / 50 microlitri. I limiti di rilevazione del test PA (formazione di agglutinazione completa) per il tipo 1, 2 e 3 PV erano 1.5x10 6 CCID 50, 5.3x10 5 CCID 50, e 9.1x10 5 CCID 50, rispettivamente 2. Il test PA correttamente identificato la maggior parte dei PV isola anche in presenza di altri non-PV enterovirus. Tuttavia, per alcuni campioni contenevano una miscela di diversi sierotipi del fotovoltaico, sierotipo minori non è riuscito a rilevare. Agglutinazione evidente dovrebbe essere formata con titolo virus sufficiente di sopra dei limiti di rilevamento. In caso di agglutinazione di anticorpi Nessun campione era chiaro o parziale, l'isola dovrebbe essere ri-amplificata nelle cellule RD per aumentare il titolo 9.

Agglutinazione parziale è stata osservata quando il titolo del virus è stata bassa e appena al di sotto dei limiti di rilevamento. Chiara differenza di agglutinazione dal controllo negativo può essere giudicata positivamente test in PA. Tuttavia, differenza molto sottile del agglutinazione giudicata positivamente indurre in errore l'interpretazione dei risultati. Pertanto, i risultati di positivo (agglutinazione parziale) dovrebbero essere utilizzati come informazioni di supporto per forse causata dai sierotipi minori degli isolati. Tuttavia, queste informazioni sarebbe utile quando l'analisi seguente (sequenziamento genomico degli isolati PV o real-time RT-PCR) ha suggerito la possibilità che il campione conteneva una miscela di diversi sierotipi del fotovoltaico, o solo agglutinazione parziale è stata osservata per Nessun campione in cui gli anticorpi il titolo del virus a bassa sarebbe la principale causa dei risultati poco chiari.

Il vantaggio di test PA per il fotovoltaico identificazione è nella semplicità della procedura e l'interpretazione dei risultati. Ciò consentirebbe di facile introduzione del test per ogni conducendo laboratori di isolamento fotovoltaici con il sistema di coltura cellulare, senza fornire attrezzature speciali, materiali, e corsi di formazione. L'utilizzo di anticorpi monoclonali specifici del tipo potrebbe consentire lo sviluppo del nuovo metodo per la differenziazione dei PV (wild-type o vaccino-come ceppi) che fornirà importanti informazioni di proprietà della PV isola con differenziazione genetica mediante RT-PCR e genomica sequenza 10, 11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Souji Masujima è un dipendente di New Product Design Department, Fujirebio Inc.

Acknowledgments

Siamo grati a Junko Wada per la sua eccellente assistenza tecnica. Siamo grati al Prof. Akio Nomoto per la gentile fornendo un vettore di espressione baculovirus per PVR-IgG2a. Questo studio è stato sostenuto in parte da sovvenzioni-in-Aid per la promozione della eradicazione della polio e della Ricerca sulle emergenti e riemergenti Malattie Infettive del Ministero della Salute, del Lavoro e del Welfare.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sensitized-gelatin particles Fujirebio Inc. Test kit
Reconstitution buffer Fujirebio Inc. Test kit
Microtitration plate Fujirebio Inc. Test kit
Anti-PV antibody RIVM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. World Health Organization. Polio Laboratory Manual (4th edition) WHO/IVB/04.10. 4th Edition, World Health Organization. (2004).
  2. Arita, M., Masujima, S., Wakita, T., Shimizu, H. Development of a particle agglutination method with soluble virus receptor for identification of poliovirus. J. Clin. Microbiol. 48, 2698-2702 (2010).
  3. Bibb, J. A., Witherell, G., Bernhardt, G., Wimmer, E. Interaction of poliovirus with its cell surface binding site. Virology. 201, 107-115 (1994).
  4. Koike, S. The poliovirus receptor protein is produced both as membrane-bound and secreted forms. Embo J. 9. 3217-3224 (1990).
  5. Mendelsohn, C. Transformation of a human poliovirus receptor gene into mouse cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 83, 7845-7849 (1986).
  6. Mendelsohn, C. L., Wimmer, E., Racaniello, V. R. Cellular receptor for poliovirus: molecular cloning, nucleotide sequence, and expression of a new member of the immunoglobulin superfamily. Cell. 56, 855-865 (1989).
  7. Arita, M., Koike, S., Aoki, J., Horie, H., Nomoto, A. Interaction of poliovirus with its purified receptor and conformational alteration in the virion. J. Virol. 72, 3578-3586 (1998).
  8. McDermott, B. M., Rux, A. H., Eisenberg, R. J., Cohen, G. H., Racaniello, V. R. Two distinct binding affinities of poliovirus for its cellular receptor. J. Biol. Chem. 275, 23089-23096 (2000).
  9. Pipkin, P. A., Wood, D. J., Racaniello, V. R., Minor, P. D. Characterisation of L cells expressing the human poliovirus receptor for the specific detection of polioviruses in vitro. J. Virol. Methods. 41, 333-340 (1993).
  10. Avoort, H. G. vander Comparative study of five methods for intratypic differentiation of polioviruses. J. Clin. Microbiol. 33, 2562-2566 (1995).
  11. Kilpatrick, D. R. Rapid group-, serotype-, and vaccine strain-specific identification of poliovirus isolates by real-time reverse transcription-PCR using degenerate primers and probes containing deoxyinosine residues. J. Clin. Microbiol. 47, 1939-1941 (2009).
Metodo di particelle agglutinazione per l'identificazione Poliovirus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arita, M., Masujima, S., Wakita, T., Shimizu, H. Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification. J. Vis. Exp. (50), e2824, doi:10.3791/2824 (2011).More

Arita, M., Masujima, S., Wakita, T., Shimizu, H. Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification. J. Vis. Exp. (50), e2824, doi:10.3791/2824 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter