Summary
Deze studie beschrijft diagnose van aviaire influenza bij wilde vogels met behulp van een draagbare RRT-PCR-systeem. De methode maakt gebruik van gevriesdroogde reagentia om het scherm wilde vogels in een niet-laboratorium setting, typisch voor een uitbraak scenario. Het gebruik van moleculaire technieken biedt nauwkeurige en gevoelige alternatieven voor een snelle diagnose.
Abstract
Wilde vogels zijn betrokken bij de verspreiding van hoogpathogene aviaire influenza (HPAI) van het H5N1 subtype, wordt gevraagd het toezicht langs trekkende vliegroutes. Bemonstering van wilde vogels voor aviaire influenza virus (AIV) is vaak uitgevoerd in afgelegen gebieden, maar de resultaten zijn vaak vertraagd vanwege de noodzaak om monsters te vervoeren naar een laboratorium ingericht voor moleculaire testen. Real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction (RRT-PCR) is een moleculaire techniek die een van de meest nauwkeurige en gevoelige methoden voor de diagnose van AIV biedt. De eerder strenge laboratorium protocollen die nodig is voor RRT-PCR worden nu aangepast voor het veld. Ontwikkeling van gevriesdroogd (gelyofiliseerd) reagentia die geen 'cold chain', met gevoeligheid bij het niveau van de natte reagentia heeft gebracht on-site testen op afstand tot een praktisch doel.
Hier presenteren we een methode voor de snelle diagnose van de AIV bij wilde vogels met behulp van een RRT-PCR-eenheid (Ruggedized Uitgebreid Pathogeen Identification Device of RAPID, Idaho Technologies, Salt Lake City, UT) dat gevriesdroogd reagentia werken (Influenza A Target een Taqman; Asay -ASY-0109, Idaho Technologies). De reagentia bevatten alle noodzakelijke componenten voor het testen op geschikte concentraties in een enkele buis: primers, probes, enzymen, buffers en interne positieve controles, waardoor fouten in verband met onjuiste opslag of overslag van natte reagentia. De draagbare eenheid voert een scherm voor het Influenza A door zich te richten de matrix-gen en levert resultaten binnen 2-3 uur. Genetische subtypering is ook mogelijk met H5 en H7 primer sets die gericht zijn op de hemagglutinine-gen.
Het systeem is geschikt voor gebruik op cloaca-en orofaryngeale monsters van wilde vogels, zoals hier gedemonstreerd op de trekkende shorebird soort, de westelijke oeverloper (Calidrus Mauri), gevangen in Noord-Californië. Dieren omgaan gevolgd protocollen zijn goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comite van de US Geological Survey West-Ecologisch Research Center en maakt van de US Geological Survey Bird Banding Laboratory. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is te versnellen diagnose van wilde vogels, het vergroten van de kans op een uitbraak op een externe locatie. On-site diagnose zou ook nuttig voor het identificeren en bestuderen van geïnfecteerde individuen in wilde populaties. De mogelijkheid om informatie op de host biologie (immunologische en fysiologische reactie op infectie) en ruimtelijke ecologie (trek de prestaties van geïnfecteerde vogels) te verzamelen geeft inzicht in de mate waarin de wilde vogels kan fungeren als vectoren voor AIV over lange afstanden.
Protocol
1. Wilde vogels te vangen met behulp van mistnetten
- Voor shorebird vast te leggen, dat is opgericht mistnetten op een actieve foerageergebied site zoals een moeras, kustlijn, of modder plat.
- Schuif schakelnetten lijn lussen van het ene uiteinde van de mist net rond de paal en verticaal steek stok in de modder.
- Strek net, steek seconden stok door schakelnetten lussen aan de andere kant van de mist net als verticaal stok in te voegen in modder, zorg ervoor dat de schakels lijnen worden onderwezen.
- Zodra een vogel is gevangen, extract van de vogel uit het net en terugkeren naar de banding station.
2. Cloaca swab bemonstering
- Verzamel cloacaswabs onmiddellijk na de vangst
- Zoek de cloaca en het gebruik van de vingertoppen terug te dringen omliggende veren
- Pak een steriel Dacron-of polyester-tip swab, stengel eind eerste, en maak de tip met een steriele virale vervoersmiddel voor meer gemak in zwabberen. Na het bevochtigen, is het hele hoofd van het wattenstaafje voorzichtig ingebracht in de cloaca. Wattenstaafje de binnenkant omtrek van de cloaca door langzaam twirling het wattenstaafje en verwijder de swab uit cloaca.
- Het plaatsen van het staafje tip direct in de virale transport media monsterflesje, draai de swab as tussen duim en wijsvinger, terwijl het staafje wordt in de media. Heb je een assistent de procedure te voltooien door te trekken de punt van het staafje terug van de bodem van de flacon ~ 1 cm en snijd de as van het staafje met een schaar, zodat het staafje tip blijft in de flacon en de as niet interfereert met cap sluiting. Cap flacon stevig vast. Desinfecteer de schaar met alcohol in tussen het snijden wattenstaafje assen.
- Plaats de vaatjes in een diepvries doos met zowel droog ijs of ijs packs.
3. Orofaryngeale wattenstaafje bemonstering
- Open voorzichtig de vogel snavel, zodat de choanal spleet zichtbaar is
- Pak een schoon wattenstaafje uit de verpakking, stam eind eerste, en maak de tip met virale vervoersmiddel voor meer gemak in zwabberen
- Zonder het aanraken van de tip op een andere oppervlakken, plaatst u deze in de mond en veeg de choanal opening op het dak van de mond en gaan terug naar de orofaryngeale of de keel regio
- Plaats het wattenstaafje tip direct in de virale transport media flacon. Draai het staafje as tussen duim en wijsvinger, terwijl het staafje wordt in de media. Zoals hierboven, hebben een assistent het uiteinde van het staafje terug te trekken uit de bodem van de flacon ~ 1 cm en snijd de as van het staafje met een schaar, zodat het staafje tip blijft in de flacon en de as niet interfereert met dop sluiting. Cap flacon stevig vast. Desinfecteer de schaar met alcohol in tussen het snijden wattenstaafje assen.
- Plaats de vaatjes in een diepvries doos met droog ijs of ijs packs.
4. Bird handling en laat
- Keer terug vogel op de site van vast te leggen en laat tijdig (<20 minuten). Handlers moeten zich bewust zijn van de beginselen van het welzijn van dieren en wees alert op tekenen van vogels lijden tijdens de bemonstering (dat wil zeggen schaafwonden, vast te leggen myopathie en hypo-of hyperthermie). Een basis EHBO-kit moet worden opgenomen in de apparatuur lijst.
5. Testfaciliteiten
- Monsters kunnen worden getest in een afgesloten ruimte, zoals een onderzoeks-caravan of tent, met een voeding (voltage-gereguleerde stroom generator) van de PCR-toestel en aangesloten computer draaien.
6. RNA-extractie
- RNA extractie werd uitgevoerd met de RNeasy Mini kit met kleine aanpassingen de instructies van de fabrikant volgende Spackman et al. 1.
- Vortex het wattenstaafje medium voor 3-5 s en overdracht 350 ul van een 2 ml microcentrifugebuis. Let op: Houd rest monster op ijs in geval PCR-positieve monsters moeten worden rescreened of H5 test moet worden uitgevoerd.
- Voeg 350 ul van RLT buffer (met β-me) en vortex voor 5 s.
- Voeg 350 ul van RNA graad 70% ethanol.
- Centrifugeer bij 5000 xg gedurende 5 minuten.
- Voeg 600 ul van de supernatant een spin kolom geplaatst in een 2 ml collectie buis. Behoudt het resterende monster in reageerbuis rek.
- Centrifugeer gedurende 20 s bij 10.000 xg en gooi flow-through.
- Herhaal de stappen 17-18 tot alle monster is gepasseerd door spin kolom.
- Plaats spin-kolom in een schone 2 ml collectie buis.
- Voeg 700 ul van RW1 buffer om de spin kolom en centrifugeer 25 s bij 10.000 x g. Gooi de flow-through.
- Voeg 500 ul RPE buffer om de spin kolom en centrifugeer gedurende 25 s bij 10.000 x g. Gooi de flow-through.
- Herhaal stap 22 voor een totaal van twee wassen met RPE buffer.
- Centrifugeer de spin kolom voor een extra 2 minuten bij 14.000 x g. Gooi collectie buis.
- Plaats de spin kolom in een schoon 1,5 ml microcentrifugebuis en voeg 50μl van nuclease-vrij water. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 60 s.
- Elueer RNA door het draaien van voor 60 s bij 10.000 xgfof 60 s. Plaats gezuiverd monster op ijs.
7. Voorbereiden negatieve controles
- Gevriesdroogde reagentia werden gereedgemaakt voor gebruik in de PCR-test volgens de instructies van de Idaho Technologies Freeze-Dried Reagens Detection Kit voor TaqMan probes Influenza A Target 1 (Asay-ASY-0109).
- Centrifuge negatieve controle reagens flesje (rood) voor 3 s om ervoor te zorgen pellets zijn aan de onderkant.
- Verwijder de dop, visueel zorg ervoor dat pellets zijn aan de onderkant.
- Voeg 20 ul van 2 X Reconstitutie Buffer en 20 ul Reagens Grade Water.
- Samenvatting en vortex gedurende 5 s op maximale snelheid.
- Centrifuge voor 3 s te brengen vloeistof naar onderkant van de flacon.
- Controleer visueel de pellet heeft gerehydrateerd, zo niet herhaal dan de stappen 31-32.
- Pipetteer 19 ul van het gehydrateerde mengsel in een LightCycler capillair, herhaalt pipet stap in een tweede capillair om een duplicaat te verkrijgen.
8. Voorbereiden van monsters voor de beproeving
- Centrifugeer het onbekende serum flacon (blauw) voor 3 sec om ervoor te zorgen pellets zijn aan de onderkant.
- Verwijder de dop, visueel zorg ervoor dat pellets zijn aan de onderkant.
- Voeg 40 ul van RNA gezuiverd.
- Samenvatting en vortex gedurende 5 s op maximale snelheid.
- Centrifuge voor 3 s te brengen vloeistof naar onderkant van de flacon.
- Controleer visueel de pellet heeft gerehydrateerd, zo niet herhaal dan de stappen 38-39.
- Pipetteer 19 ul van gehydrateerd mengsel in een LightCycler capillair, herhaalt pipet stap in een tweede capillair om een duplicaat te verkrijgen.
9. Voorbereiden positieve controles
- Centrifugeer de positieve controle reagens flesje (groen) voor 3 s om ervoor te zorgen pellets zijn aan de onderkant.
- Verwijder de dop, visueel zorg ervoor dat pellets zijn aan de onderkant.
- Voeg 20 ul van 2 X Reconstitutie Buffer en 20 ul Reagens Grade Water.
- Samenvatting en vortex gedurende 5 s op maximale snelheid.
- Centrifuge voor 3 s te brengen vloeistof naar onderkant van de flacon.
- Controleer visueel de pellet heeft gerehydrateerd, zo niet herhaal dan de stappen 45-46.
- Pipetteer 19 ul van het gehydrateerde mengsel in een LightCycler capillair, herhaalt pipet stap in een tweede capillair om een duplicaat te verkrijgen.
10. Centrifugeren het capillair
- Wanneer alle van de capillaire buizen voor de partij zijn voorbereid laden ze in de mini-centrifuge voorzien van capillaire adapters.
- Centrifugeer op de laagste stand van de pols houden ingedrukt voor een s. Deze transfers vloeistof naar de bodem als voorbereiding voor het testen.
11. Bediening van de RAPID
- Maak een nieuw bestand. Label positieve controle, negatieve controle, en de monsters (door hun ID-nummer).
- Programma 1: RNA Monstervoorbereiding Hold
- Cycli = 1
- Analyse Mode = Geen
- Doel Temperatuur = 40
- Incubatie tijd = 30 min.
- Temperatuur Transition Rate = 20 ° C / s (standaard)
- Secundaire Temperatuur Target = 0 (standaard)
- Stap Size = 0 (standaard)
- Stap Delay = 0 (standaard)
- Acquisitie Mode = Geen (standaard)
- Programma 2: RNA Denaturatie
- Cycli = 1
- Analyse Mode = Geen
- Doel Temperatuur = 94
- Incubatietijd = 120s
- Temperatuur Transition Rate = 20 ° C / s (standaard)
- Secundaire Temperatuur Target = 0 (standaard)
- Stap Size = 0 (standaard)
- Stap Delay = 0 (standaard)
- Acquisitie Mode = Geen (standaard)
- Programma 3: RNA Amplification
- Cycli = 45
- Analyse Mode = Auto Analyse
- Gewenste temperatuur, Segment 1 = 94; Segment 2 = 60
- Incubatietijd, Segment 1 = 0 s, Segment 2 = 20 s
- Temperatuur Transition Rate, Seg 1 & 2 = 20 ° C / s (standaard)
- Secundaire Temperatuur Target, Seg 1 & 2 = 0 (standaard)
- Stapgrootte, Seg 1 & 2 = 0 (standaard)
- Stap Delay, Seg 1 & 2 = 0 (standaard)
- Acquisitie Mode, Segment 1 = Geen; Segment 2 = single
- Fluorescentie Parameters
- Display Mode: fluorescentie kanaal 2 (CH2 / 1)
Winsten:- Ch 1 (F1) = 1
- Ch 2 (F2) = 8
- Ch 3 (F3) = 1
- Als u de real-time fluorescentie data voor elk monster, selecteert u de steekproef van belang en klik op de 'Show Graph' knop aan de onderkant van het scherm
- Display Mode: fluorescentie kanaal 2 (CH2 / 1)
- Voor elke capillair, de resultaten omvatten het volgende:
- # - Identificeert de carrousel positie van de carrousel
- Sample naam - geeft de naam van het monster
- Control - identificeert het monster type voor elk monster
- Score - berekend op basis van de relatie tussen fluorescentie van het monster en het niveau van de achtergrond fluorescentie in het monster
- Resultaat - geeft het totale resultaat voor het monster
12. Representatieve resultaten:
Aanwezig: 'aanwezig' Een rode oproep voor een test / onbekende monster geeft aan dat het doel was die in dat monster en de controles waren succesvol.Niet gedetecteerd: Een groene 'niet herkend' oproep voor een test / onbekende monster geeft aan dat de doelstelling niet werd geïdentificeerd in dat monster en de test controles waren succesvol.
Herhaal: Een 'kunt u herhalen' geeft aan dat de positieve of negatieve controle mislukt.
Een voorbeeld van een succesvolle analyse van de RAPID 7200 is weergegeven in Figuur 4. De positieve controle wordt versterkt en genereert detecteerbare fluorescentie (y-as) bij ongeveer 25 cycli (x-as). Een cyclus drempel (CT)> 35 is de overeengekomen cut-off voor de meeste AIV referentielaboratoria. Daarom is de positieve controle voor deze methode leverde een fluorescent signaal binnen de geaccepteerde aantal cycli (0-35) voor de AIV detectie. In tegenstelling, is de negatieve controle niet het genereren van een fluorescent signaal, zelfs na 45 cycli. Evenzo heeft de twaalf monsters uit West-strandlopers niet het genereren van een fluorescent signaal dat aangeeft dat de vogels negatief waren voor AIV. Follow-up testen van alle positieve monsters in een traditioneel laboratorium is aangemoedigd ervoor te zorgen dat er geen valse positieven ten onrechte worden geproduceerd.
Figuur 1. Shorebird vast te leggen met behulp van mistnetten.
Figuur 2. Inzameling van cloacaswabs en orofaryngeale monsters uit de minst strandlopers.
Figuur 3. Programmeren van de RAPID 7200 voor RNA-amplificatie.
Figuur 4. Fluorogram gegenereerd door de RAPID 7200 portable RRT-PCR laten zien hoe positieve en negatieve controles zou moeten verschijnen in een succesvolle test. Klik hier om de volledige grootte te bekijken
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De methode van een snelle diagnose hier gepresenteerde maakt tijd-efficiënte en nauwkeurige testen van wilde vogels monsters voor bewaking van de AIV. De veel minder strenge exemplaar opslag eisen van draagbare RRT-PCR zijn geschikt voor het op afstand situaties waarin het onderhoud van een 'cold chain' kan onpraktisch als vloeibare stikstof verladers of droog ijs is niet beschikbaar. Daarnaast vonden we dat monster-analyse met gevriesdroogde reagentia was eenvoudig genoeg om te worden uitgevoerd door veldbiologen met minimale kennis van laboratorium op basis van moleculaire analyse. De techniek was het tijd-efficiënt en ook kosten-effectief is. Met een exploitant, het haalbaar was om drie partijen draaien, wat resulteert in 42 screenings voor AIV elke dag in een veld setting. Wij hebben dat alle materialen die nodig zijn om dit systeem te draaien kan worden gebracht op een locatie en de methodologie kan worden geleerd om een operator in de loop van een dag. De beperkende factor in afgelegen veld situaties is de voeding nodig is om de draagbare RRT-PCR toestel en aangesloten computer draaien, maar dit kan worden verzacht door het gebruik van een voltage-gereguleerde draagbare elektrische generator. Daarnaast, sequentiebepaling van het geëxtraheerde RNA of het oorspronkelijke monster is alleen mogelijk in gevallen waarin de 'cold chain' tijdelijk kan worden gehandhaafd tot de levering aan een laboratorium.
Onze vorige analyse gaf aan dat de draagbare RRT-PCR toestel identiek zijn specificiteit (100%) en vergelijkbare sensitiviteit (98%) aan virusisolatie uitgevoerd in een laboratorium setting2 had. Vorige validatie studies hebben aangetoond dat er valse negatieven zijn de meest voorkomende fout met RRT-PCR als gevolg van het grote potentieel voor oneigenlijke monstervoorbereiding, de aanwezigheid van de PCR-inhibitoren in fecaal materiaal of afbraak van het gevriesdroogde reagens kraal 1,3-4. Een andere tekortkoming van de techniek is de gevoeligheid van gevriesdroogde reagentia in het licht van nieuw opkomende stammen van AIV. Het virus bevindt zich in een constante staat van genomische herschikking waar hosts elkaar overlappen, een hypothese wordt ondersteund door tal van fylogenetische studies 5-8. Vandaar dat primers en probes uitgegeven voor gebruik met draagbare RRT-PCR vergen constante re-validatie. Bijvoorbeeld, zijn reagentia specifiek voor de Amerikaanse en de Euraziatische lineages van de subtypes H5 en H7 nu aanbevolen door de divergentie van het virus volgens de biogeografische regio 9. Net als bij alle andere praktijktests, vermoed HPAIV positieven moet worden vervoerd naar een erkende faciliteit voor definitieve bevestiging testen met VI voor de hoogste specificiteit en gevoeligheid 10.
Kortom, deze studie toonde aan dat draagbare RRT-PCR geschikt is voor het doel van de screening cloacaal monsters van wilde vogels voor de AIV in niet-laboratorium instellingen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is te versnellen diagnose van wilde vogels, het vergroten van de kans op een uitbraak in een afgelegen locatie met een snellere responstijd. Draagbare RRT-PCR is ook een doorbraak voor onderzoekers die streven naar de rol van wilde vogels in de verspreiding van AIV te ontrafelen. De mogelijkheid om de status van gastheer diagnose op het moment van de bemonstering maakt het mogelijk om biologische informatie te verzamelen om belangrijke vragen over de immunologische en fysiologische reacties 11 tot en met infectie, of genetische kenmerken in verband met natuurlijke weerstand in het wild levende vogels 12-mailadres. Bovendien zou inzetten van dure satelliet-zenders op betekende hosts om hun bewegingen te volgen van onschatbare waarde zijn voor het identificeren van welke soorten fungeren als lange afstand dragers van AIV alsmede de beoordeling van hun trekkende prestaties, habitat voorkeuren en niveaus van interactie met pluimvee. Toekomstige operationele testen op het gebied van de internationale bezorgdheid voor HPAIV, zoals Midden-en Zuid-Azië 13, zou definitief te bepalen hoe snel RRT-PCR-units presteren onder uitbraak scenario's wanneer de diagnose van een groot aantal positieve monsters is de tijd-kritisch.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij willen M. en R. Scullion Crisp van Idaho Technologies bedanken voor technische ondersteuning en het USGS West-Ecologisch Research Center voor de financiering van (S. Schwarzbach) en bijstand (K. Spragens, T. Graham). Dit onderzoek werd uitgevoerd onder auspiciën van het Centrum voor Innovatieve technologie - Instituut voor Defensie en Binnenlandse Veiligheid (www.idhs.org), ter ondersteuning van het ministerie van Defensie en Air Force Research Laboratory. Dieren omgaan gevolgd protocollen zijn goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comite van de US Geological Survey West-Ecologisch Research Center en maakt van de US Geological Survey Bird Banding Laboratory. Elk gebruik van de handel, product of bedrijf namen in deze publicatie is voor beschrijvende doeleinden en impliceert geen goedkeuring door de Amerikaanse overheid.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNeasy mini spin column | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Collection tubes (1.5 & 2 mL) | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Buffer RLT | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Buffer RW1 | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Buffer RPE | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| RNase-free water | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| 14.3 M β-mercapt–thanol solution | Fisher Scientific | BP176100 | |
| 100% ethanol | Fisher Scientific | NC9602322 | |
| Vortex Genie 2, 120V | Scientific Industries Inc. | SI-0236 | |
| Taqman Influenza A Target 1 (Hydrolysis Probe) | Idaho Technologies | ASAY-ASY-0109 | |
| Lightcycler 20ml capillary tubes | Roche Group | 04929292001 | |
| Micro-centrifuge with rotator for 2 ml tubes | Idaho Technologies | Included in RAPID kit | |
| Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device (RAPID) 7200 | Idaho Technologies | Included in RAPID kit | |
| Pentium-based laptop with Windows XP Professional | Idaho Technologies | Included in RAPID kit | |
| Lightcycler Data Analysis software | Idaho Technologies | Included in RAPID kit |
References
- Spackman, E. Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes. J Clin Microbiol. 40, 3256-3260 (2002).
- Takekawa, J. Y. Field detection of avian influenza virus in wild birds: evaluation of a portable rRT-PCR system and freeze-dried reagents. J Virol Methods. 166, 92-97 (2010).
- Das, A., Spackman, E., Senne, D., Pedersen, J., Suarez, D. L. Development of an internal positive control for rapid diagnosis of avian influenza virus infections by real-time reverse transcription-PCR with lyophilized reagents. J Clin Microbiol. 44, 3065-3073 (2006).
- Spackman, E., Suarez, D. L. Avian influenza virus RNA extraction from tissue and swab material. Methods Mol Biol. 436, 13-18 (2008).
- Chen, R., Holmes, E. C. Frequent inter-species transmission and geographic subdivision in avian influenza viruses from wild birds. Virology. , 383-3156 (2009).
- Macken, C. A., Webby, R. J., Bruno, W. J. Genotype turnover by reassortment of replication complex genes from avian influenza A virus. J Gen Virol. 87, 2803-2815 (2006).
- Dugan, V. G. The evolutionary genetics and emergence of avian influenza viruses in wild birds. PLoS Pathog.. 4, e1000076-e1000076 (2008).
- Spackman, E. Phylogenetic analyses of type A influenza genes in natural reservoir species in North America reveals genetic variation. Virus Res. 114, 89-100 (2005).
- Pasick, J. Advances in the molecular based techniques for the diagnosis and characterization of avian influenza virus infections. Transbound Emerg Dis. 55, 329-338 (2008).
- OIE Manual of diagnostics tests and vaccines for terrestrial animals (mammals, birds and bees). 1, 258-269 (2004).
- Weber, T. P., Stilianakis, N. I. Ecologic immunology of avian influenza (H5N1) in migratory birds. Emerg. Infect. Dis. 13, 1139-1143 (2007).
- Kim, J. -K., Negovetich, N. J., Forrest, H. L., Webster, R. G. Ducks: the "Trojan Horses" of H5N1 influenza. Influenza and Other Respiratory Viruses. , 121-128 (2009).
- Gilbert, M. Flying over an infected landscape: distribution of highly pathogenic avian influenza H5N1 risk in South Asia and satellite tracking of wild waterfowl. Ecohealth. , (2010).
