Summary
Denna studie beskriver diagnos av aviär influensa hos vilda fåglar med hjälp av en bärbar RRT-PCR-system. Metoden drar nytta av frystorkat reagens skärmen vilda fåglar i en icke-laboratoriemiljö, typiskt för ett utbrott scenario. Användning av molekylära verktyg ger exakta och känsliga alternativ för snabb diagnos.
Abstract
Vilda fåglar har varit inblandade i spridningen av högpatogen aviär influensa (HPAI) av subtyp H5N1, vilket ledde till övervakning tillsammans flyttfåglar flyttvägar. Provtagning av vilda fåglar för aviär influensa-virus (AIV) genomförs ofta i avlägsna områden, men resultaten är ofta försenade på grund av behovet av att transportera proverna till ett laboratorium utrustat för molekylär testning. Real-time omvänt transkriptas polymeraskedjereaktion (RRT-PCR) är en molekylär teknik som erbjuder en av de mest exakta och känsliga metoder för diagnostik av AIV. Den tidigare strikta labbet protokoll som behövs för RRT-PCR är nu anpassade för fältet. Utveckling av frystorkade (frystorkad) reagens som inte kräver kylkedja, med känslighet i nivå med våta reagens har fört på plats fjärrkontroll tester för att ett konkret mål.
Här presenterar vi en metod för snabb diagnos av AIV hos vilda fåglar med hjälp av en RRT-PCR enhet (Robust Avancerad Patogen anordning för identifiering eller snabb, Idaho Technologies, Salt Lake City, UT) som sysselsätter frystorkat reagens (Influensa A Mål 1 Taqman; Asay -ASY-0109, Idaho Technologies). Reagensen innehåller alla nödvändiga komponenter för att testa vid lämpliga koncentrationer i en enda rör: grundfärger, sonder, enzymer, buffertar och interna positiva kontroller, eliminera fel i samband med felaktig förvaring eller hantering av våt reagenser. Den bärbara enheten utför en skärm för influensa A genom att rikta matrisen genen och ger resultat på 2-3 timmar. Genetiska subtypning är också möjligt med H5 och H7 primer ställer som riktar sig mot hemagglutinin genen.
Systemet är lämpligt för användning på svabbprover och munhåla prover som tagits från vilda fåglar, vilket visas här på flyttande vadare arter, västra snäppor (Calidrus Mauri) fångade i norra Kalifornien. Djurhantering följt protokoll godkänts av Djurens skötsel och användning kommitté US Geological Survey västra Ekologisk Research Center och tillstånd av US Geological Survey Bird Banding Laboratory. Den främsta fördelen med denna teknik är att påskynda diagnos av vilda fåglar, ökar chanserna med ett utbrott i en avlägsen plats. På plats diagnos skulle också visa sig vara användbart för att identifiera och studera infekterade individer i vilda populationer. Möjligheten att samla in information om värd biologi (immunologiska och fysiologiska svaret på infektion) och rumsliga ekologi (flyttande prestanda smittade fåglar) kommer att ge insikter i vilken utsträckning vilda fåglar kan fungera som vektorer för AIV över långa avstånd.
Protocol
1. Vildfågel ta med dimma nät
- För vadare fånga, skapa dimma nät på ett aktivt födosök webbplats som ett träsk, strandlinje, eller lera platt.
- Skjut grimgarn linje slingor i ena änden av dimman nätet runt stången och sätt stången vertikalt i leran.
- Sträck ut nätet, sätt in second pol genom grimgarn loopar i andra änden av dimma netto och vertikalt in stången i lera, och se till att grimgarn linjer lärs ut.
- När en fågel är fångad, extrahera fågeln från nätet och återgå till banding stationen.
2. Svabbprover provstickan provtagning
- Samla kloak omedelbart efter fångsten
- Leta reda på kloaken och använd fingertopparna för att trycka tillbaka omgivande fjädrar
- Packa en steril Dacron-eller Polyester spets kompress, stam änden först, och fukta spetsen med en steril virustransportmedia större lätthet i svabbar. Efter fuktas är hela huvudet av pinnen försiktigt förs in i kloaken. Kompress insidan omkrets kloak genom att långsamt snurrande pinnen och ta bort pinnen ur kloak.
- Sätta pinnen spets direkt i virustransportmedia prov flaskan, rotera pinnen axeln mellan tummen och pekfingret när pinnen är i media. Låt en medhjälpare avsluta förfarandet genom att dra i spetsen av pinnen tillbaka från botten av flaskan ~ 1 cm och skär skaftet pinnen med en sax så pinnen spetsen kvar i flaskan och axeln påverkar inte CAP stängning. Cap flaskan ordentligt. Desinficera sax med alkohol i mellan skärande pinnen axlar.
- Placera rören i en frys box innehållande antingen torris eller is förpackningar.
3. Orofaryngeal provstickan provtagning
- Öppna försiktigt fågelns näbb så att choanal skåran syns
- Packa en ren kompress från paketet, stam änden först, och fukta spetsen med virustransportmedia större lätthet i svabbar
- Utan att vidröra spetsen på alla andra ytor, sätt in det i munnen och torka av choanal öppningen på taket i munnen och fortsätter tillbaka mot munhåla eller hals regionen
- Placera pinnen spets direkt i virustransportmedia flaskan. Rotera pinnen axeln mellan tummen och pekfingret när pinnen är i media. Som ovan, har en assistent dra toppen av pinnen tillbaka från botten av flaskan ~ 1 cm och skär skaftet pinnen med en sax så pinnen spetsen kvar i flaskan och axeln påverkar inte locket stängning. Cap flaskan ordentligt. Desinficera sax med alkohol i mellan skärande pinnen axlar.
- Placera rören i en frys box som innehåller torris eller is förpackningar.
4. Bird hantering och släpp
- Återgå fågel till platsen för fångst och släppa i rätt tid (<20 min). Hundföraren bör vara medveten om principerna för djurskydd och vara uppmärksam på tecken på fåglar som lider under provtagning (t.ex. skrubbsår, fånga myopati och hypo-eller hypertermi). En grundläggande förbandslåda bör ingå i utrustningslistan.
5. Testanläggningar
- Prover kan testas i något slutet utrymme såsom en forskningsgrupp släpvagn eller tält, med ett nätaggregat (spänningsreglerad generator) för att köra PCR-enheten och ansluten dator.
6. RNA-extraktion
- RNA-extraktion utfördes med RNeasy Mini kit med mindre ändringar till tillverkarens instruktioner Följande Spackman et al. 1
- Vortex pinnen medium för 3-5 s och överföra 350 l till ett 2 ml mikrocentrifugrör. Obs: Håll resten prov på is vid PCR-positiva prov behöver genomgå ny screening eller H5 testa behöver köras.
- Tillsätt 350 ìl RLT buffert (med β-me) och skaka i 5 s.
- Tillsätt 350 l av RNA-klass 70% etanol.
- Centrifugera vid 5000 xgi 5 minuter.
- Tillsätt 600 l av supernatanten till en spin kolumn placeras i en 2 ml provröret. Behåll de resterande provet i provrör rack.
- Centrifugera i 20 s vid 10000 xg och kasta genomströmning.
- Upprepa steg 17-18 tills alla prov har passerat genom spin kolumn.
- Sätt snurr kolumn i ett rent 2 ml-provrör.
- Tillsätt 700 ìl RW1 buffert för att snurra kolonnen och centrifugera 25 s vid 10000 x g. Kassera genomströmning.
- Tillsätt 500 l RPE buffert för att snurra kolonnen och centrifugera i 25 s vid 10000 x g. Kassera genomströmning.
- Upprepa steg 22 för totalt två tvättar med RPE buffert.
- Centrifugera snurra kolumnen för ytterligare 2 minuter på 14.000 x g. Kassera provröret.
- Placera snurra kolonnen i ett rent 1,5 ml mikrocentrifugrör och tillsätt 50μl av nukleasfritt vatten. Inkubera vid rumstemperatur i 60 s.
- Eluera RNA genom att snurra i 60 s vid 10000 XGFeller 60 S. Placera renas prov på is.
7. Förbereda negativa kontroller
- Frystorkad reagenser var förberedda för användning i PCR-analys enligt instruktioner från Idaho Technologies frystorkade Reagens Detection Kit för TaqMan prober influensa A Mål 1 (Asay-ASY-0109).
- Centrifugera negativa injektionsflaska kontrollreagens (röd) i 3 s för att pellets är längst ner.
- Ta bort locket, visuellt se till pellets är längst ner.
- Tillsätt 20 l på 2 x Rekonstitution Buffer och 20 l reagenskvalitet Vatten.
- Recap och vortexa i 5 sekunder vid maximal hastighet.
- Centrifugera i 3 s för att få vätska till botten av flaskan.
- Visuellt kontrollera pellets har uppblött, om inte upprepa steg 31-32.
- Pipettera 19 ìl av hydratiserade blandningen i en LightCycler kapillärrör, upprepa pipett kliva in i en andra kapillär att få en dubblett.
8. Förbereda proverna
- Centrifugera det okända reagens flaskan (blå) i 3 sek för att pellets är längst ner.
- Ta bort locket, visuellt se till pellets är längst ner.
- Tillsätt 40 l renat RNA.
- Recap och vortexa i 5 sekunder vid maximal hastighet.
- Centrifugera i 3 s för att få vätska till botten av flaskan.
- Visuellt kontrollera pellets har uppblött, om inte upprepa steg 38-39.
- Pipettera 19 ìl hydratiserade blandningen i en LightCycler kapillärrör, upprepa pipett kliva in i en andra kapillär att få en dubblett.
9. Förbereda positiva kontroller
- Centrifugera den positiva flaskan kontrollreagens (grön) i 3 s för att säkerställa pellets är längst ner.
- Ta bort locket, visuellt se till pellets är längst ner.
- Tillsätt 20 l på 2 x Rekonstitution Buffer och 20 l reagenskvalitet Vatten.
- Recap och vortexa i 5 sekunder vid maximal hastighet.
- Centrifugera i 3 s för att få vätska till botten av flaskan.
- Visuellt kontrollera pellets har uppblött, om inte upprepa steg 45-46.
- Pipettera 19 ìl av hydratiserade blandningen i en LightCycler kapillärrör, upprepa pipett kliva in i en andra kapillär att få en dubblett.
10. Centrifugering av kapillärrör
- När alla kapillärrör för partiet har upprättats lasta dem till mini-centrifug utrustas med kapillär adaptrar.
- Centrifugera vid den lägsta inställningen genom att hålla pulsen knappen intryckt i 1 s. Detta överför vätskan till botten som en förberedelse för testning.
11. Använda RAPID
- Skapa en ny fil. Label positiv kontroll, negativ kontroll, och prover (genom deras ID-nummer).
- Program 1: RNA Provberedning Håll
- Cykler = 1
- Analys-läge = Ingen
- Måltemperatur = 40
- Inkubationstid = 30 min
- Temperatur utflödet = 20 ° C / s (standard)
- Sekundär Temperatur target = 0 (standard)
- Steg Size = 0 (standard)
- Steg Delay = 0 (standard)
- Förvärv Mode = Ingen (standard)
- Program 2: RNA Denaturering
- Cykler = 1
- Analys-läge = Ingen
- Måltemperatur = 94
- Inkubationstid = 120S
- Temperatur utflödet = 20 ° C / s (standard)
- Sekundär Temperatur target = 0 (standard)
- Steg Size = 0 (standard)
- Steg Delay = 0 (standard)
- Förvärv Mode = Ingen (standard)
- Program 3: RNA-amplifiering
- Cykler = 45
- Analys läge = Auto Analys
- Måltemperaturen, Segment 1 = 94, Segment 2 = 60
- Inkubationstid Segment 1 = 0 s, Segment 2 = 20 s
- Temperatur utflödet, Seg 1 & 2 = 20 ° C / s (standard)
- Sekundär temperaturmål, Seg 1 & 2 = 0 (standard)
- Steg Storlek, Seg 1 & 2 = 0 (standard)
- Steg Delay, Seg 1 & 2 = 0 (standard)
- Förvärv Mode, Segment 1 = Ingen, Segment 2 = enstaka
- Fluorescensparametrarna
- Visningsläge: fluorescens kanal 2 (CH2 / 1)
Vinster:- Ch 1 (F1) = 1
- Ch 2 (F2) = 8
- Ch 3 (F3) = 1
- För att visa i realtid fluorescens data för varje prov, urvalet av intresse och klicka på "Visa graf" längst ned på skärmen
- Visningsläge: fluorescens kanal 2 (CH2 / 1)
- För varje kapillär, resultaten omfatta följande:
- # - Identifierar karusellen position karusellen
- Exempel på namn - ger namnet på provet
- Control - indentifies provtypen för varje prov
- Betyg - beräknas utifrån förhållandet mellan provets fluorescens och nivån på bakgrundsfluorescens i provet
- Resultat - visar det samlade resultatet för provet
12. Representativa resultat:
Närvarande: En röd "nu" krav på en test / okända provet visar att målet identifierades i provet och kontrollerna var framgångsrika.Inte upptäckts: En grön "inte upptäcks" Ring för test / okända provet visar att målet inte har identifierats i provet och testet kontroller var framgångsrika.
Upprepa: En "vänlig repetera" anger att positiva eller negativa kontrollen misslyckades.
Ett exempel på en framgångsrik analys av den snabba 7200 visas i Figur 4. Den positiva kontrollen förstärks och skapar detekterbara fluorescens (y-axel) vid ca 25 cykler (x-axel). En cykel tröskel (CT)> 35 är den överenskomna cut-off för de flesta AIV referenslaboratorier. Därför tillverkas de positiva kontrollerna för denna metod en fluorescerande signal inom den accepterade antal cykler (0-35) för AIV upptäckt. Däremot genererar den negativa kontrollen inte en fluorescerande signal även efter 45 cykler. Likaså gjorde tolv prover som samlats in från västra Sandpipers genererar inte en fluorescerande signal som visar att fåglarna var negativa för AIV. Uppföljning testning av alla positiva prov i en traditionell laboratorium uppmuntras att säkerställa att inga falska positiva felaktigt produceras.
Figur 1. Shorebird ta med dimma nät.
Figur 2. Insamling av svabbprover och orofaryngeal prover från minst Sandpipers.
Figur 3. Programmering Rapid 7200 för RNA förstärkning.
Figur 4. Fluorogram genereras av RAPID 7200 bärbara RRT-PCR som visar hur positiva och negativa kontroller bör finnas i ett lyckat test. Klicka här för att se full storlek
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden för snabb diagnos presenteras här underlättar tidseffektiv och noggrann testning av vilda fåglar prover för övervakning av AIV. Den mycket mindre stränga forvaring kraven för bärbara RRT-PCR är lämpliga för avlägsna situationer där underhåll av kylkedjan kan vara opraktiskt om flytande kväve avlastare eller torris är inte tillgänglig. Dessutom fann vi att provanalys med frystorkat reagens var tillräckligt enkla för att utföras av fältet biologer med minimal kunskap om laboratorie-baserade molekylär analys. Tekniken var tidseffektiv och dessutom kostnadseffektivt. Med en operatör, var det möjligt att köra tre partier, vilket resulterade i 42 filmvisningar för AIV varje dag i ett fält inställning. Vi bedömde att allt material som behövs för att driva detta system kunde föras till valfri plats och den metod som kan läras ut till en operatör under loppet av en dag. Den begränsande faktorn i avlägsna fält situationer är strömförsörjningen som krävs för att köra den bärbara RRT-PCR-enheten och ansluten dator, men kan detta mildras med hjälp av en spänningsreglerad bärbar elgenerator. Dessutom sekvensering av de extraherade RNA eller det ursprungliga urvalet är endast möjligt i de fall där kylkedjan kan tillfälligt bibehållas tills leverans till ett laboratorium.
Vår tidigare analys visade att den bärbara RRT-PCR-enhet hade identiska specificitet (100%) och jämförbar sensitivitet (98%) till virusisolering utföras i ett laboratorium setting2. Tidigare valideringsstudier har visat att falska negativa är de vanligaste felet med RRT-PCR grund av den stora potential för felaktig provberedning, närvaron av PCR-inhibitorer i fekalt material eller nedbrytning av den frystorkade reagenset pärla 1,3-4. En annan brist i tekniken är känsligheten med frystorkat reagens med tanke på nya framväxande stammar av AIV. Viruset är i ett konstant tillstånd av genomiska möblera var värdar överlappar varandra, en hypotes stöds av flera fylogenetiska studier 5-8. Därför grundfärger och sonder som utfärdats för användning med bärbara RRT-PCR kräver ständig re-validering. Till exempel är reagenser speciella för amerikanska och eurasiska linjer av H5 och H7 rekommenderas nu på grund av skillnaderna mellan viruset enligt biogeografisk region 9. Som med alla andra fältförsök, misstänkt HPAIV positiva skall transporteras till en godkänd anläggning för slutlig bekräftelse testning med VI för högsta specificitet och känslighet 10.
Sammanfattningsvis visade denna studie att bärbara RRT-PCR är lämplig för syftet med screening svabbprover prover från vilda fåglar för AIV i icke-laboratoriet inställningar. Den främsta fördelen med denna teknik är att påskynda diagnos av vilda fåglar, ökar chanserna med ett utbrott i en avlägsen plats med en snabbare responstid. Bärbar RRT-PCR utgör också ett genombrott för forskare som försöker nysta roll vilda fåglar i spridningen av AIV. Möjligheten att diagnostisera värd status vid tiden för provtagningen gör det möjligt att samla in biologisk information för att hantera viktiga frågor om immunologiska och fysiologiska reaktioner 11 till infektion, eller genetiska egenskaper med naturlig motståndskraft hos vilda fåglar 12. Dessutom skulle distribuera kostsamma satellitsändare på bekräftade värdar för att spåra deras rörelser vara ovärderliga för att identifiera vilka arter fungerar som långväga bärare av AIV samt bedöma deras vandrande prestanda, preferenser livsmiljö och nivåer av interaktion med fjäderfä. Framtida operativa tester i områden av internationellt intresse för HPAIV, som Central-och Sydasien 13, skulle slutgiltigt avgöra hur snabb RRT-PCR-enheterna prestera under utbrottet scenarier vid diagnos av ett stort antal positiva prover är tidskritisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi vill tacka M. KÖKSPOJKE och R. Skarp i Idaho Teknik för teknisk support och USGS västra Ecological Research Center för finansiering (S. Schwarzbach) och bistånd (K. Spragens, T. Graham). Denna forskning utfördes inom ramen för Centrum för innovativ teknik - Institutet för försvaret och Homeland Security (www.idhs.org), till stöd för försvarsdepartementet och Air Force Research Laboratory. Djurhantering följt protokoll godkänts av Djurens skötsel och användning kommitté US Geological Survey västra Ekologisk Research Center och tillstånd av US Geological Survey Bird Banding Laboratory. All användning av handels-, produkt eller företag i denna publikation är beskrivande syfte och innebär inte godkännande av den amerikanska regeringen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNeasy mini spin column | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Collection tubes (1.5 & 2 mL) | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Buffer RLT | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Buffer RW1 | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Buffer RPE | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| RNase-free water | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| 14.3 M β-mercapt–thanol solution | Fisher Scientific | BP176100 | |
| 100% ethanol | Fisher Scientific | NC9602322 | |
| Vortex Genie 2, 120V | Scientific Industries Inc. | SI-0236 | |
| Taqman Influenza A Target 1 (Hydrolysis Probe) | Idaho Technologies | ASAY-ASY-0109 | |
| Lightcycler 20ml capillary tubes | Roche Group | 04929292001 | |
| Micro-centrifuge with rotator for 2 ml tubes | Idaho Technologies | Included in RAPID kit | |
| Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device (RAPID) 7200 | Idaho Technologies | Included in RAPID kit | |
| Pentium-based laptop with Windows XP Professional | Idaho Technologies | Included in RAPID kit | |
| Lightcycler Data Analysis software | Idaho Technologies | Included in RAPID kit |
References
- Spackman, E. Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes. J Clin Microbiol. 40, 3256-3260 (2002).
- Takekawa, J. Y. Field detection of avian influenza virus in wild birds: evaluation of a portable rRT-PCR system and freeze-dried reagents. J Virol Methods. 166, 92-97 (2010).
- Das, A., Spackman, E., Senne, D., Pedersen, J., Suarez, D. L. Development of an internal positive control for rapid diagnosis of avian influenza virus infections by real-time reverse transcription-PCR with lyophilized reagents. J Clin Microbiol. 44, 3065-3073 (2006).
- Spackman, E., Suarez, D. L. Avian influenza virus RNA extraction from tissue and swab material. Methods Mol Biol. 436, 13-18 (2008).
- Chen, R., Holmes, E. C. Frequent inter-species transmission and geographic subdivision in avian influenza viruses from wild birds. Virology. , 383-3156 (2009).
- Macken, C. A., Webby, R. J., Bruno, W. J. Genotype turnover by reassortment of replication complex genes from avian influenza A virus. J Gen Virol. 87, 2803-2815 (2006).
- Dugan, V. G. The evolutionary genetics and emergence of avian influenza viruses in wild birds. PLoS Pathog.. 4, e1000076-e1000076 (2008).
- Spackman, E. Phylogenetic analyses of type A influenza genes in natural reservoir species in North America reveals genetic variation. Virus Res. 114, 89-100 (2005).
- Pasick, J. Advances in the molecular based techniques for the diagnosis and characterization of avian influenza virus infections. Transbound Emerg Dis. 55, 329-338 (2008).
- OIE Manual of diagnostics tests and vaccines for terrestrial animals (mammals, birds and bees). 1, 258-269 (2004).
- Weber, T. P., Stilianakis, N. I. Ecologic immunology of avian influenza (H5N1) in migratory birds. Emerg. Infect. Dis. 13, 1139-1143 (2007).
- Kim, J. -K., Negovetich, N. J., Forrest, H. L., Webster, R. G. Ducks: the "Trojan Horses" of H5N1 influenza. Influenza and Other Respiratory Viruses. , 121-128 (2009).
- Gilbert, M. Flying over an infected landscape: distribution of highly pathogenic avian influenza H5N1 risk in South Asia and satellite tracking of wild waterfowl. Ecohealth. , (2010).
