Summary
इस अध्ययन से एक पोर्टेबल प्रणाली है आर आर टी - पीसीआर का उपयोग जंगली पक्षियों में एवियन इन्फ्लूएंजा के निदान का वर्णन करता है. विधि फ्रीज सूखे अभिकर्मकों का लाभ लेता है एक गैर प्रयोगशाला सेटिंग में जंगली पक्षियों, एक प्रकोप परिदृश्य की विशिष्ट स्क्रीन. आणविक उपकरणों का प्रयोग तेजी से निदान के लिए सटीक और संवेदनशील विकल्प प्रदान करता है.
Protocol
1. जंगली पक्षी धुंध नेट का उपयोग कर कब्जा
- Shorebird पर कब्जा के लिए, एक दलदल, shoreline, या फ्लैट कीचड़ के रूप में एक सक्रिय foraging साइट पर धुंध जाल सेट.
- स्लाइड जाला लाइन पोल के चारों ओर धुंध शुद्ध के एक छोर की loops और पोल कीचड़ में खड़ी सम्मिलित है.
- शुद्ध बाहर खींचो, जाला loops के माध्यम से धुंध नेट के दूसरे छोर पर दूसरा ध्रुव और कीचड़ में खड़ी सम्मिलित पोल सम्मिलित करते हैं, तो सुनिश्चित करें कि जाला लाइनों सिखाया जाता है.
- एक बार एक पक्षी पर कब्जा कर लिया है, नेट से पक्षी निकालने और बैंडिंग स्टेशन पर लौटने.
2. Cloacal झाड़ू नमूने
- कब्जा करने के बाद तुरंत cloacal swabs लीजिए
- क्लोअका का पता लगाएँ और उंगलियों का उपयोग करने के लिए वापस आसपास के पंख धक्का
- एक बाँझ Dacron या पॉलिएस्टर इत्तला दे दी झाड़ू खोलना करने के लिए, अंत में पहली बार स्टेम, और बाँझ swabbing में अधिक से अधिक आराम के लिए वायरल परिवहन मीडिया के साथ नोक गीला. Moistening के बाद, झाड़ू के पूरे सिर धीरे क्लोअका में डाला जाता है. झाड़ू से साफ़ करना धीरे धीरे झाड़ू twirling और क्लोअका से झाड़ू हटायें द्वारा क्लोअका के अंदर परिधि.
- वायरल परिवहन मीडिया नमूना शीशी में सीधे झाड़ू टिप डालने, अंगूठे और तर्जनी के बीच झाड़ू शाफ्ट को घुमाएगी जबकि झाड़ू मीडिया में है. शीशी ~ 1 सेमी की गहराई से झाड़ू वापस की नोक खींच द्वारा एक सहायक कार्यविधि को पूरा करने और झाड़ू के शाफ्ट काट कैंची की एक जोड़ी के साथ तो झाड़ू टिप शीशी में रहता है और शाफ्ट के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है टोपी बंद. कैप कसकर शीशी. झाड़ू शाफ्ट काटने के बीच में शराब के साथ कैंची कीटाणुरहित.
- एक फ्रीजर या तो सूखी बर्फ या बर्फ पैक वाले बॉक्स में शीशियों रखें.
3. Oropharyngeal झाड़ू नमूने
- धीरे चिड़िया चोंच खोलने इतना है कि choanal भट्ठा दिखाई देता है
- पैकेज से एक साफ झाड़ू खोलना, अंत में पहली बार स्टेम, और वायरल परिवहन मीडिया के साथ swabbing में अधिक से अधिक आराम के लिए टिप गीला
- किसी अन्य सतहों के टिप को छू के बिना, यह मुंह और मुँह की छत पर झाड़ू choanal खोलने में डालने और oropharyngeal या गले क्षेत्र की ओर वापस जारी रखने
- वायरल परिवहन मीडिया शीशी में सीधे झाड़ू टिप रखें. अंगूठे और तर्जनी के बीच झाड़ू शाफ्ट घुमाएँ जबकि झाड़ू मीडिया में है. इसके बाद के संस्करण के रूप में है, एक सहायक शीशी ~ 1 सेमी की गहराई से झाड़ू वापस की नोक खींच और कैंची की एक जोड़ी के साथ झाड़ू की शाफ्ट में कटौती तो झाड़ू टिप शीशी में रहता है और शाफ्ट टोपी के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है बंद. कैप कसकर शीशी. झाड़ू शाफ्ट काटने के बीच में शराब के साथ कैंची कीटाणुरहित.
- एक फ्रीजर सूखी बर्फ या बर्फ पैक वाले बॉक्स में शीशियों रखें.
4. बर्ड से निपटने और रिहाई
- पक्षी पर कब्जा है और एक समय पर ढंग (20mins <) में रिलीज की साइट पर लौटें. संचालकों पशु कल्याण के सिद्धांतों के बारे में पता हो और पक्षी के नमूने के दौरान पीड़ित संकेत (अर्थात् abrasions, मायोपथी और hypo-या अतिताप पर कब्जा) के लिए सचेत होना चाहिए. एक बुनियादी प्राथमिक चिकित्सा किट के उपकरणों की सूची में शामिल किया जाना चाहिए.
5. परीक्षण सुविधाएं
- नमूने एक अनुसंधान ट्रेलर या तम्बू के रूप में किसी भी संलग्न अंतरिक्ष में परीक्षण किया जा सकता है एक बिजली की आपूर्ति (वोल्टेज विनियमित बिजली जनरेटर) पीसीआर यूनिट और संलग्न कंप्यूटर चलाने के साथ.
6. शाही सेना निष्कर्षण
- शाही सेना निकासी Spackman एट अल के बाद निर्माता के निर्देशों के मामूली संशोधनों के साथ RNeasy मिनी किट के साथ प्रदर्शन किया गया था 1.
- भंवर 3-5 एस के लिए झाड़ू मध्यम और एक 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब 350 μl हस्तांतरण. नोट: शेष नमूना बर्फ पर रखें मामले में पीसीआर सकारात्मक नमूने rescreened या H5 परीक्षण चलाने की जरूरत की जरूरत है.
- RLT बफर के 350 μl (β-मुझे के साथ) और एस के लिए 5 भंवर जोड़ें
- शाही सेना ग्रेड 70% इथेनॉल के 350 μl जोड़ें.
- 5 मिनट के लिए 5,000 XG पर अपकेंद्रित्र.
- एक स्पिन एक 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में रखा स्तंभ की सतह पर तैरनेवाला 600 μl जोड़ें. टेस्ट ट्यूब रैक में शेष नमूना रखें.
- 20 s के लिए १०,००० XG और प्रवाह के माध्यम से त्यागें पर अपकेंद्रित्र.
- दोहराएँ 17-18 कदम जब तक सभी नमूना स्पिन कॉलम के माध्यम से पारित किया गया है.
- एक साफ 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में स्पिन स्तंभ रखें.
- स्पिन स्तंभ RW1 बफर के 700 μl जोड़ें और +१०,००० एक्स जी पर 25 एस अपकेंद्रित्र प्रवाह के माध्यम से त्यागें.
- स्पिन और 25 एस के लिए स्तंभ अपकेंद्रित्र 10,000 एक्स जी में 500 μl RPE बफर जोड़ें प्रवाह के माध्यम से त्यागें.
- RPE बफर के साथ दो washes के एक कुल के लिए 22 कदम दोहराएँ.
- +१४००० एक्स जी पर एक अतिरिक्त 2 मिनट के लिए स्पिन स्तंभ अपकेंद्रित्र संग्रह ट्यूब त्यागें.
- एक साफ 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में स्पिन स्तंभ प्लेस और nuclease मुफ्त पानी के 50μl जोड़ने. 60 एस के लिए कमरे के तापमान पर सेते
- 10,000 xgf में 60 s के लिए कताई द्वारा Elute शाही सेनाया 60 एस जगह बर्फ पर नमूना शुद्ध.
7. नकारात्मक नियंत्रण की तैयारी
- Lyophilized अभिकर्मकों पीसीआर परख में उपयोग के लिए Idaho टेक्नोलॉजीज अभिकर्मक रुक - सूखे जांच किट से TaqMan जांच इन्फ्लुएंजा एक 1 लक्ष्य (ASAY - ASY 0109) के लिए निर्देशों के अनुसार तैयार किया गया.
- 3 एस के लिए नकारात्मक नियंत्रण अभिकर्मक शीशी (लाल) अपकेंद्रित्र करने के लिए सुनिश्चित करें छर्रों तल पर हैं.
- टोपी निकालें, नेत्रहीन सुनिश्चित करें कि छर्रों के तल पर हैं.
- 2 एक्स पुनर्गठन बफर और 20 μl अभिकर्मक ग्रेड पानी के 20 μl जोड़ें.
- रिकैप और अधिकतम गति से 5 एस के लिए भंवर.
- 3 एस के लिए अपकेंद्रित्र शीशी के नीचे करने के लिए तरल लाने के लिए.
- नेत्रहीन जाँच गोली rehydrated है, अगर 31-32 कदम दोहराना नहीं.
- पिपेट एक Lightcycler केशिका ट्यूब में हाइड्रेटेड मिश्रण के 19 μl, एक दूसरे केशिका में पिपेट कदम दोहराने के लिए एक नकली प्राप्त.
8. तैयारी के नमूने परीक्षण
- 3 सेकंड के लिए अज्ञात अभिकर्मक शीशी अपकेंद्रित्र (नीला) करने के लिए सुनिश्चित करें छर्रों तल पर हैं.
- टोपी निकालें, नेत्रहीन सुनिश्चित करें कि छर्रों के तल पर हैं.
- शुद्ध शाही सेना के 40 μl जोड़ें.
- रिकैप और अधिकतम गति से 5 एस के लिए भंवर.
- 3 एस के लिए अपकेंद्रित्र शीशी के नीचे करने के लिए तरल लाने के लिए.
- नेत्रहीन जाँच गोली rehydrated है, अगर 38-39 कदम दोहराना नहीं.
- पिपेट एक Lightcycler केशिका ट्यूब में हाइड्रेटेड मिश्रण के 19 μl, एक दूसरे केशिका में पिपेट कदम दोहराने के लिए एक नकली प्राप्त.
9. सकारात्मक नियंत्रण की तैयारी
- 3 एस के लिए सकारात्मक नियंत्रण अभिकर्मक शीशी (हरा) अपकेंद्रित्र करने के लिए सुनिश्चित करें छर्रों तल पर हैं.
- टोपी निकालें, नेत्रहीन सुनिश्चित करें कि छर्रों के तल पर हैं.
- 2 एक्स पुनर्गठन बफर और 20 μl अभिकर्मक ग्रेड पानी के 20 μl जोड़ें.
- रिकैप और अधिकतम गति से 5 एस के लिए भंवर.
- 3 एस के लिए अपकेंद्रित्र शीशी के नीचे करने के लिए तरल लाने के लिए.
- नेत्रहीन जाँच गोली rehydrated है, अगर 45-46 कदम दोहराना नहीं.
- पिपेट एक Lightcycler केशिका ट्यूब में हाइड्रेटेड मिश्रण के 19 μl, एक दूसरे केशिका में पिपेट कदम दोहराने के लिए एक नकली प्राप्त.
10. केशिका ट्यूब Centrifuging
- एक बार जब बैच के लिए केशिका ट्यूब की सभी मिनी केशिका एडेप्टर के साथ फिट अपकेंद्रित्र में उन्हें लोड करने के लिए तैयार किया गया है.
- पल्स बटन नीचे पकड़े द्वारा 1 एस के लिए सबसे कम सेटिंग में अपकेंद्रित्र इस परीक्षण के लिए तैयार करने में नीचे तरल स्थानान्तरण.
11. त्वरित आपरेटिंग
- एक नई फ़ाइल बनाएँ. लेबल नियंत्रण सकारात्मक, नकारात्मक नियंत्रण, और नमूने (उनके ID संख्या द्वारा).
- 1 कार्यक्रम: शाही सेना नमूना तैयार पकड़ो
- साइकिल = 1
- विश्लेषण मोड कोई नहीं =
- टारगेट तापमान = 40
- ऊष्मायन समय = 30 मिनट
- तापमान संक्रमण दर = 20 ° / सी (डिफ़ॉल्ट)
- माध्यमिक तापमान लक्ष्य = 0 (डिफ़ॉल्ट)
- चरण आकार = 0 (डिफ़ॉल्ट)
- चरण विलंब = 0 (डिफ़ॉल्ट)
- अधिग्रहण मोड कोई नहीं = (डिफ़ॉल्ट)
- Program 2: शाही सेना denaturation
- साइकिल = 1
- विश्लेषण मोड कोई नहीं =
- टारगेट तापमान = 94
- ऊष्मायन समय = 120s
- तापमान संक्रमण दर = 20 ° / सी (डिफ़ॉल्ट)
- माध्यमिक तापमान लक्ष्य = 0 (डिफ़ॉल्ट)
- चरण आकार = 0 (डिफ़ॉल्ट)
- चरण विलंब = 0 (डिफ़ॉल्ट)
- अधिग्रहण मोड कोई नहीं = (डिफ़ॉल्ट)
- 3 कार्यक्रम: शाही सेना प्रवर्धन
- साइकिल = 45
- विश्लेषण मोड ऑटो = विश्लेषण
- टारगेट तापमान, खंड 1 = 94, 2 खंड 60 =
- ऊष्मायन समय, खंड 1 = 0 एस, खंड 2 = 20 एस
- तापमान संक्रमण दर, 1 और 2 Seg = 20 ° C / s (डिफ़ॉल्ट)
- माध्यमिक तापमान लक्ष्य, Seg 1 & 2 = 0 (डिफ़ॉल्ट)
- चरण आकार, Seg 1 & 2 = 0 (डिफ़ॉल्ट)
- चरण देरी, Seg 1 & 2 = 0 (डिफ़ॉल्ट)
- अधिग्रहण मोड, 1 = कोई भी खंड, खंड 2 = एकल
- प्रतिदीप्ति पैरामीटर्स
- प्रतिदीप्ति 2 चैनल (1 / CH2): मोड प्रदर्शित
लाभ:- 1 चौधरी (F1) = 1
- Ch 2 (F2) = 8
- Ch 3 (F3) = 1
- प्रत्येक नमूना के लिए वास्तविक समय प्रतिदीप्ति डेटा प्रदर्शित करने के लिए, ब्याज के नमूने का चयन करें और स्क्रीन के नीचे स्थित 'दिखाएँ ग्राफ़' बटन पर क्लिक करें
- प्रतिदीप्ति 2 चैनल (1 / CH2): मोड प्रदर्शित
- प्रत्येक केशिका के लिए, परिणाम में निम्नलिखित शामिल हैं:
- # हिंडोला के हिंडोला स्थिति को दिखाता है
- नमूना नाम - नमूने के नाम प्रदान करता है
- नियंत्रण - प्रत्येक नमूने के लिए नमूना प्रकार indentifies
- स्कोर - नमूने में नमूना प्रतिदीप्ति और पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के स्तर के बीच के रिश्ते का उपयोग कर की गणना
- परिणाम - नमूने के लिए समग्र परिणाम प्रदर्शित करता है
12. प्रतिनिधि परिणाम:
वर्तमान: एक लाल / अज्ञात नमूना परीक्षण के लिए 'वर्तमान' कॉल इंगित करता है कि लक्ष्य है कि नमूने में पहचान की थी और नियंत्रण सफल रहे थे.नहीं पता चला: / अज्ञात नमूना परीक्षण के लिए एक हरे रंग का पता चला नहीं कॉल इंगित करता है कि लक्ष्य है कि नमूने में पहचान नहीं किया गया था और परीक्षण नियंत्रण सफल रहे थे.
कृपया दोहराने: एक 'दोहराने कृपया' इंगित करता है कि सकारात्मक या नकारात्मक नियंत्रण में विफल रहा है.
त्वरित 7200 के द्वारा एक सफल विश्लेषण का एक उदाहरण चित्रा 4 में दिखाया गया है. सकारात्मक नियंत्रण प्रवर्धित है और लगभग 25 चक्र (x-अक्ष) पर detectable प्रतिदीप्ति (y-अक्ष) उत्पन्न करता है. एक चक्र (सीटी) दहलीज 35> सबसे AIV संदर्भ प्रयोगशालाओं के लिए सहमत हुए बंद कटौती है. इसलिए, इस विधि के लिए सकारात्मक नियंत्रण AIV पता लगाने के लिए स्वीकार किए जाते हैं चक्रों की संख्या (0-35) फ्लोरोसेंट संकेत के भीतर उत्पादन किया. इसके विपरीत, नकारात्मक नियंत्रण 45 चक्रों के बाद भी एक फ्लोरोसेंट संकेत नहीं उत्पन्न करता है. इसी प्रकार, पश्चिमी Sandpipers से बारह नमूने एकत्र एक फ्लोरोसेंट यह दर्शाता है कि पक्षियों AIV के लिए नकारात्मक रहे थे संकेत उत्पन्न नहीं किया था. अनुवर्ती एक पारंपरिक प्रयोगशाला में सभी के लिए सकारात्मक नमूने का परीक्षण करने के लिए सुनिश्चित करें कि कोई झूठी सकारात्मक ग़लती से उत्पादित कर रहे हैं करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है.
चित्रा 1. Shorebird धुंध नेट का उपयोग कर कब्जा.
चित्रा 2 से कम से कम Sandpipers cloacal और oropharyngeal नमूने का संग्रह.
चित्रा 3 शाही सेना के प्रवर्धन के लिए त्वरित 7200 प्रोग्रामिंग.
चित्रा 4. त्वरित 7200 आर आर टी - पीसीआर पोर्टेबल दिखा कैसे एक सफल परख में सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण प्रकट होना चाहिए द्वारा उत्पन्न Fluorogram लिए यहाँ क्लिक करें पूर्ण आकार छवि को देखने के
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Discussion
तेजी से निदान यहाँ प्रस्तुत की विधि AIV की निगरानी के लिए जंगली पक्षियों के नमूने के समय कुशल और सटीक परीक्षण की सुविधा. पोर्टेबल आर आर टी - पीसीआर के बहुत कम कड़े नमूना भंडारण आवश्यकताओं दूरस्थ स्थितियों जहां एक कोल्ड चेन के रखरखाव अव्यावहारिक हो सकता है अगर तरल नाइट्रोजन shippers या सूखी बर्फ उपलब्ध नहीं है, हो सकता है के लिए उपयुक्त हैं. इसके अलावा, हम है कि फ्रीज सूखे अभिकर्मकों के साथ नमूना विश्लेषण में पाया गया है काफी सरल क्षेत्र जीव प्रयोगशाला आधारित आणविक विश्लेषण के न्यूनतम ज्ञान के साथ प्रदर्शन किया जा रहा था. समय कुशल और भी लागत प्रभावी तकनीक था. एक ऑपरेटर के साथ, यह तीन बैचों चलाने के लिए संभव था, AIV के लिए 42 चोकर में प्रत्येक दिन परिणामस्वरूप एक क्षेत्र की स्थापना में. हम मूल्यांकन कि इस प्रणाली को चलाने के लिए आवश्यक सभी सामग्री किसी भी स्थान और पद्धति एक दिन के कोर्स पर एक ऑपरेटर के लिए सिखाया जा सकता है लाया जा सकता है है. दूरस्थ क्षेत्र स्थितियों में सीमित कारक शक्ति आपूर्ति पोर्टेबल इकाई आर आर टी - पीसीआर और संलग्न कंप्यूटर चलाने के लिए आवश्यक है, तथापि, यह एक वोल्टेज विनियमित पोर्टेबल बिजली जनरेटर का उपयोग के माध्यम से कम किया जा सकता है. इसके अलावा, निकाले शाही सेना या मूल नमूना के अनुक्रमण केवल मामलों में जहां कोल्ड चेन अस्थायी रूप से एक प्रयोगशाला के लिए प्रसव तक बनाए रखा जा सकता है में संभव है.
हमारे पिछले विश्लेषण में संकेत दिया है कि पोर्टेबल इकाई आर आर टी - पीसीआर समान विशिष्टता (100%) और वायरस एक प्रयोगशाला setting2 में प्रदर्शन अलगाव के लिए तुलनीय संवेदनशीलता (98%) था. पिछले सत्यापन अध्ययन दिखा दिया है कि झूठी नकारात्मक आर आर टी - पीसीआर के साथ सबसे आम त्रुटि अनुचित या lyophilized अभिकर्मक मनका 1,3-4 fecal सामग्री गिरावट में पीसीआर inhibitors का नमूना तैयार उपस्थिति के लिए बड़ी क्षमता की वजह से कर रहे हैं. तकनीक का एक अन्य कमी AIV के नए उभरते उपभेदों के दृश्य में lyophilized अभिकर्मकों की संवेदनशीलता है. वायरस जीनोमिक फेरबदल की एक निरंतर राज्य में है जहाँ भी मेजबान ओवरलैप करते हैं, एक परिकल्पना कई वंशावली 5-8 अध्ययन के द्वारा समर्थित . इसलिए पोर्टेबल आर आर टी - पीसीआर के साथ प्रयोग के लिए जारी प्राइमरों और जांच फिर से सत्यापन लगातार की आवश्यकता है. उदाहरण के लिए, H5 और H7 उपप्रकार के अमेरिकी और यूरेशियाई प्रजातियों के लिए विशिष्ट अभिकर्मकों अब जीव भौगोलिक क्षेत्र 9 के लिए अनुसार कर रहे हैं वायरस के विचलन की वजह से सिफारिश की है. जैसा कि अन्य सभी क्षेत्र परीक्षण के साथ संदिग्ध, HPAIV सकारात्मक उच्चतम विशिष्टता और 10 संवेदनशीलता के लिए छठी के साथ अंतिम पुष्टि परीक्षण के लिए एक अनुमोदित की सुविधा के लिए ले जाया जाना चाहिए.
अंत में, इस अध्ययन दिखा दिया है कि पोर्टेबल आर आर टी - पीसीआर गैर प्रयोगशाला सेटिंग में AIV के लिए जंगली पक्षियों से cloacal नमूने स्क्रीनिंग के प्रयोजन के लिए उपयुक्त है. इस तकनीक का प्राथमिक लाभ के लिए जंगली पक्षियों के निदान में तेजी लाने के लिए है, एक तेजी से प्रतिक्रिया समय के साथ एक दूरस्थ स्थान में एक प्रकोप से युक्त संभावना बढ़ रही है. पोर्टेबल आर आर टी - पीसीआर भी शोधकर्ताओं कि AIV के प्रसार में जंगली पक्षियों की भूमिका सुलझाना की तलाश के लिए एक सफलता का प्रतिनिधित्व करता है. नमूने के समय मेजबान स्थिति का निदान करने की क्षमता है यह संभव जैविक जानकारी एकत्र करने के लिए प्रतिरक्षाविज्ञानी और शारीरिक 11 संक्रमण के लिए प्रतिक्रियाओं, या जंगली पक्षियों में प्राकृतिक 12 प्रतिरोध के साथ जुड़े आनुवंशिक विशेषताओं के बारे में महत्वपूर्ण सवालों के पते बनाता है. इसके अलावा, उनके आंदोलनों को ट्रैक करने के लिए पुष्टि की मेजबान पर महंगा उपग्रह ट्रांसमीटरों की तैनाती की पहचान जो प्रजातियों AIV की लंबी दूरी की वाहक के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पॉल्ट्री के साथ उनके प्रवासी प्रदर्शन, निवास स्थान वरीयताओं को और बातचीत के स्तर का आकलन के रूप में कार्य करने के लिए अमूल्य होगा. HPAIV के लिए अंतरराष्ट्रीय चिंता का विषय क्षेत्रों, जैसे मध्य और दक्षिण एशिया के 13, में भविष्य परिचालन परीक्षण निर्णायक निर्धारित कैसे तेजी से आर आर टी - पीसीआर इकाइयों प्रकोप परिदृश्यों के तहत प्रदर्शन है जब सकारात्मक नमूनों की एक बड़ी संख्या के निदान के समय महत्वपूर्ण है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम तकनीकी सहायता और धन (एस Schwarzbach) और सहायता (के. Spragens, टी. ग्राहम) के लिए USGS पश्चिमी पर्यावरण रिसर्च सेंटर के लिए एम. Scullion और इडाहो टेक्नोलॉजीज आर कुरकुरा धन्यवाद. रक्षा और मातृभूमि सुरक्षा (www.idhs.org) के लिए रक्षा विभाग और वायु सेना अनुसंधान प्रयोगशाला के समर्थन में संस्थान इस शोध अभिनव प्रौद्योगिकी के लिए केंद्र के तत्वावधान में किया गया था. पशु हैंडलिंग पशु देखभाल और अमेरिकी भूवैज्ञानिक सर्वेक्षण पश्चिमी पारिस्थितिक रिसर्च सेंटर और अमेरिकी भूवैज्ञानिक सर्वेक्षण प्रयोगशाला बैंडिंग बर्ड के परमिट का प्रयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल का पालन किया. इस प्रकाशन में व्यापार, उत्पाद या फर्म के नाम का कोई भी उपयोग वर्णनात्मक प्रयोजनों के लिए ही है और अमेरिकी सरकार द्वारा बेचान संकेत नहीं है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNeasy mini spin column | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Collection tubes (1.5 & 2 mL) | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Buffer RLT | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Buffer RW1 | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Buffer RPE | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| RNase-free water | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| 14.3 M β-mercapt–thanol solution | Fisher Scientific | BP176100 | |
| 100% ethanol | Fisher Scientific | NC9602322 | |
| Vortex Genie 2, 120V | Scientific Industries Inc. | SI-0236 | |
| Taqman Influenza A Target 1 (Hydrolysis Probe) | Idaho Technologies | ASAY-ASY-0109 | |
| Lightcycler 20ml capillary tubes | Roche Group | 04929292001 | |
| Micro-centrifuge with rotator for 2 ml tubes | Idaho Technologies | Included in RAPID kit | |
| Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device (RAPID) 7200 | Idaho Technologies | Included in RAPID kit | |
| Pentium-based laptop with Windows XP Professional | Idaho Technologies | Included in RAPID kit | |
| Lightcycler Data Analysis software | Idaho Technologies | Included in RAPID kit |
References
- Spackman, E. Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes. J Clin Microbiol. 40, 3256-3260 (2002).
- Takekawa, J. Y. Field detection of avian influenza virus in wild birds: evaluation of a portable rRT-PCR system and freeze-dried reagents. J Virol Methods. 166, 92-97 (2010).
- Das, A., Spackman, E., Senne, D., Pedersen, J., Suarez, D. L. Development of an internal positive control for rapid diagnosis of avian influenza virus infections by real-time reverse transcription-PCR with lyophilized reagents. J Clin Microbiol. 44, 3065-3073 (2006).
- Spackman, E., Suarez, D. L. Avian influenza virus RNA extraction from tissue and swab material. Methods Mol Biol. 436, 13-18 (2008).
- Chen, R., Holmes, E. C. Frequent inter-species transmission and geographic subdivision in avian influenza viruses from wild birds. Virology. , 383-3156 (2009).
- Macken, C. A., Webby, R. J., Bruno, W. J. Genotype turnover by reassortment of replication complex genes from avian influenza A virus. J Gen Virol. 87, 2803-2815 (2006).
- Dugan, V. G. The evolutionary genetics and emergence of avian influenza viruses in wild birds. PLoS Pathog.. 4, e1000076-e1000076 (2008).
- Spackman, E. Phylogenetic analyses of type A influenza genes in natural reservoir species in North America reveals genetic variation. Virus Res. 114, 89-100 (2005).
- Pasick, J. Advances in the molecular based techniques for the diagnosis and characterization of avian influenza virus infections. Transbound Emerg Dis. 55, 329-338 (2008).
- OIE Manual of diagnostics tests and vaccines for terrestrial animals (mammals, birds and bees). 1, 258-269 (2004).
- Weber, T. P., Stilianakis, N. I. Ecologic immunology of avian influenza (H5N1) in migratory birds. Emerg. Infect. Dis. 13, 1139-1143 (2007).
- Kim, J. -K., Negovetich, N. J., Forrest, H. L., Webster, R. G. Ducks: the "Trojan Horses" of H5N1 influenza. Influenza and Other Respiratory Viruses. , 121-128 (2009).
- Gilbert, M. Flying over an infected landscape: distribution of highly pathogenic avian influenza H5N1 risk in South Asia and satellite tracking of wild waterfowl. Ecohealth. , (2010).
