Summary
هو مفصل في زرع الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) في النخاع الشوكي للفئران مع إزالة الميالين المعمول بها. إعداد NSCs ، هي الخطوط العريضة لاستئصال الصفيحه من الفقرات الصدرية 9 (T9) ، وزرع NSCs جنبا إلى جنب مع الرعاية قبل وبعد العملية ، من الفئران.
Abstract
فئران مصابة بسلالة فيروس موجه للعصب JHM التهاب الكبد الماوس (MHV) وضع النتائج المرضية والسريرية للمرضى مماثلة مع مرض التصلب المتعدد المزيل (MS). وقد أظهرت لنا أن زرع NSCs في النخاع الشوكي للمريض في الفئران النتائج تحسنا كبيرا في كل من وعودة الميالين في نتائج سريرية. العلاجات البديلة للخلايا لعلاج الأمراض العصبية المزمنة أصبحت الآن حقيقة واقعة في النماذج الحية والحيوية في فهم التفاعلات بين الخلايا المضيفة المكروية engrafted والأنسجة. هذا العرض يوفر وسيلة لزرع الخلايا تتكيف في النخاع الشوكي للفئران المصابة JHMV. باختصار ، نحن نقدم لإجراء ط) إعداد NSCs قبل الزرع ، والثاني) قبل العملية الرعاية من الفئران ، والثالث) تعرض الحبل الشوكي من خلال الثقب ، والرابع) من حقن المجسم NSCs ، والرابع) الرعاية اللاحقة للعمليات الجراحية .
Protocol
1. إعداد
- إعداد زيلازين - الكيتامين الحل (الكيتامين هو مادة خاضعة للرقابة ، وينبغي الاحتفاظ بسجلات تفصيلية وحلول تخزين في مكان آمن مؤمن).
- تنظيف وتعقيم المعدات.
- تعد منطقة الجراحة بواسطة المسح مع وكيل العقيم ثم تغطي مع المناشف الورقية المعقمة ، وإعداد micromanipulator.
2. التحضير لزرع الخلايا
- وينبغي معلق الخلايا إلى خلايا تركيز 100000 / ل هاء وعلى الرغم من أن الخلايا المزروعة 250000 فقط في الماوس ، يلزم وجود فائض من الخلايا لأغراض التحميل حقنة (إعداد ما لا يقل عن 300،000 الخلايا في الخلايا المستقبلة الماوس).
- غسل الخلايا المراد زرعها 3 مرات في HBSS في قارورة a مخروطية 50 مل. عد الخلايا قبل تدور النهائي.
- بعد الدوران النهائي لأسفل ، وترك HBSS صب في قارورة الموقف رأسا على عقب لمنع قطرات من الوصول إلى بيليه.
- داخل الجدران الجافة مع Kimwipe ، المشع للأشعة فوق البنفسجية العقيمة. لا تسمح بيليه لتجف.
- عقد أنبوب تستقيم ، ببطء وبحذر شديد resuspend الخلايا في نصف النهائي حجم المطلوب من HBSS.
- قياس حجم إجمالي pipetting غالبية تعليق في تلميح ماصة ثم ضبط الطلب على pipetter حتى وقف كامل في الطرف ماصة. هذا وسوف اقول لكم كم من HBSS هناك حاجة للتركيز المطلوب.
- ليصل حجم المبلغ المطلوب عن طريق إضافة HBSS.
- المكان مرة أخرى على الجليد. التحقق من جدوى إذا كانت الخلايا يجب أن يكون على الجليد لفترة أطول من 2 ساعة.
3. اعداد الفئران للجراحة وزرع
- تخدير الماوس عن طريق الحقن داخل الصفاق الكيتامين (100mg/kg) وزيلازين (10mg/kg) في جرعات 100 ~ ميكرولتر مخدر أو ما يعادلها. فإن الإجراء بأكمله من الإعدادية جراحية لخياطة تستغرق دقائق 30-40.
- (اختياري : تطبيق مرقمة ، الشريط الملون لذيل كل فأر لضمان تحديد الهوية)
- حلق المنطقة الظهرية للفأرة من أسفل الظهر إلى الرقبة ، وتمتد 2 سم الثنائية من خط الوسط ، مع كليبرز الكهربائية. يجب قص الشعر في أقرب وقت ممكن (قد يكون من الضروري أن يذهب فوق المنطقة عدة مرات).
- لإزالة الشعر المتبقي ، وتطبيق طبقة رقيقة من كريم إزالة الشعر (نير) مع شاش يميل قضيب.
- بعد 1-2 دقائق ، امسح ناير قبالة بشاش مبلل بالماء والصابون برفق. وينبغي أن تكون المنطقة مستعدة عارية الجلد نظيفة دون أي قطعة من الشعر الضالة التي يمكن أن تحصل في الجرح أثناء إجراء العمليات الجراحية لاحقا.
تعقيم المنطقة مستعدة بمحلول يوديد.
4. استئصال الصفيحه
- كثيرا ما تتغير و / أو تعقيم القفازات في جميع أنحاء الداخلي. موقف الجانب الظهري الماوس مع رئيس لافتا إلى اليسار (إذا كنت الحق وسلم). ثنى الحيوانية لضمان العقم ، وأنه لا يتم كشفها في منطقة الحلق. جعل شق عمودي (~ 1.3cm) عبر موقع laminecomy الممتدة من حوالي الفقرات الصدرية T8 و T12.
- مع ملقط غريف الذي عقد في اليد اليسرى ، وتأمين بقوة العمود الفقري في T9 (الشكل 1A) ورفع الماوس تصل إلى المبالغة في انحناء العمود الفقري.
- استخدام مشرط ليسجل تقاطع بين T10 T11 و، المسافة بين نتوءات two شائك. كشف مزيد من تقاطع طريق الغاء بعناية بعيدا الطبقة العضلية لفضح العظام (انظر الشكل 1B ، C).
- استخدم المقص لمزيد من العضلات واضحة بعيدا عن الصفيحة وحول عنيق مع القصاصات الصغيرة. وهذا الانفتاح على مسافة صغيرة بين فقرات. ببطء وبحذر ادخال شفرة واحدة من مقص في هذه الفجوة وقص عنيق. تأكد من وضعه دائما انحناء جانبيا للمقص ، بعيدا عن السلك. كرر على الجانب الآخر. (انظر الشكل 1D ، E)
- رفع الصفيحة لفضح قص الحبل وبعناية تشغيله. تأكد من عدم ترك أي شظايا العظام مجانا أو خشنة وراءهم. (انظر الشكل 1F)
- قبل الحقن ونظيفة بعيدا مع أي دم قطعة قطن معقمة.
5. حقن الخلايا
- إرفاق الإبرة مع الجوز إبرة المحقنة إلى هاميلتون وتنظيفها من قبل بيغ عدة مرات بالماء ، ثم الايثانول 70 ٪ ، وأخيرا HBSS. إدراج المكبس بعد كل ملء مع الماء ، والإيثانول 70 ٪ ، أو HBSS.
- تحضير حقنة هاميلتون لتحميل الخلية عن طريق إزالة المكبس وتخفيف الجوز الإبرة وسحب الإبرة بعيدا عن حقنة لمنع الضغط الخلفي. ضمان أن تتم معالجة متأنية للإبر والجوز مع قفازات معقمة.
- تحميل 15μl من الخلايا في تلميح ماصة واضغط على تلميح بإحكام في نهاية الجزء الخلفي من حقنة لتحميل الخلايا في المحقنة.
- إدراج الغواص عن 5mm ثم تشديد الجوز الإبرة.
- الامم المتحدة تخفض الغطاسسمسم وينظر بعض التعليق الخلية تخرج الإبرة.
- تأكد من عدم وجود فقاعات في محقنة ووضع حقنة لأسفل في وضع أفقي لمنع الخلايا من صنع التدرج عن طريق الجاذبية.
- امساك الماوس laminectomized من العضلات النخاعي الظهرية من العمود الفقري الذي يربط T8 و T9 (الشكل 2B ، C).
- المشبك في مرقئ إلى الذراع الأيسر micromanipulator (العمودي) بحيث الكفوف الماوس ، الأمامية في الهواء ولمس الكفوف الخلفي طفيفة منبرا للمناشف ورقية معقمة كما هو الحال في أرقام 2A و 2B.
- نعلق المحقنة إلى الذراع micromanipulator اليمين (بزاوية · 70) والشريحة المحقنة إلى أدنى موقف ممكن قبل لقط.
- استقرار الماوس تعلق ذيله ضد المناشف الورقية وانخفاض ببطء المحقنة (2B الشكل).
- انخفاض الإبرة نحو الحبل وإدراج 1MM إبرة في نصف الكرة الآخر من خلال خط الوسط الظهرية (الشكل 2C). يجب أن رأس الإبرة تكون في المادة الرمادية على مقربة من القناة المركزية.
- حقن ببطء 2.5μl من الخلايا. حقن بمعدل 1μl / 5 ثوان. بعد حقن الخلايا ، وانتظر 10 ثانية وسحب الإبرة عشر منعطفا في وقت واحد كل 10 ثانية حتى الإبرة خارج السلك. إيلاء الاهتمام لهروب رأس المال من الممكن تعليق الخلية.
- التراجع بسرعة المحاقن وسلخه من الذراع micromanipulator. وضع الحقنة باستمرار أفقيا.
- الافراج عن الماوس ونقل إلى الجدول خياطة.
- كرر الخطوات 5،7-5،14 لكل الماوس حتى يتم إفراغ الحقنة. تعقيم الأدوات (في جهاز التعقيم) والإبرة (عن طريق المسح مع الايثانول) بين الحيوانات. تجاهل الخلايا وإذا كان تكتل تحديث مرئيا.
- تنظيف حقنة كما في الخطوة 5.1 بين الأحمال.
6. الخيوط الجراحية والرعاية بعد العملية
- خياطة الفتحة. يتم إدخال إبرة خياطة في اللفافة السطحية على جانبي الشق. هو موتر الخيط من خلال سحب اللفافة السطحية معا (الشكل 3A) ، وتغطي بذلك الحبل الشوكي معرضة في موقع الصفيحة إزالتها. لا خياطة العضلات الجلدي تعلق على الجلد أو العضلات والهيكل العظمي من الظهر. سحب الخيط من خلال كامل ، وترك ما يقرب من 1 / 2 ". استخدام حامل الإبرة ، وشكلت ثلاثة عقدة ، ويتم قطع الصفحات أقرب إلى عقدة ممكن.
- إغلاق شق طريق تطبيق 2-3 المواد الغذائية (اعتمادا على حجم الجرح) على الجلد (الشكل 3B). سحب الجلد بعناية بعيدا عن الماوس لتجنب التدبيس العضلات الأساسية.
- باستخدام 26G3 / 8 إبرة حقن قارعو الأجراس Lactated 0.5ml الفرعي cutaneously في أسفل الظهر بعيدا عن الشق.
- مكان الماوس مرة أخرى في قفصه. لضمان أنها قادرة على التنفس بشكل مريح بينما تحت التخدير ، ويجب وضع الماوس على جانبها في القفص ، وتجنب الاتصال بين الموقع والفراش جراحة القفص. يجب أن توضع على منصات أقفاص التدفئة.
- ويتم رصد الفئران بعد التخدير يلبس لضمان تهدأ النزيف ، وخياطة الجروح لا تزال مغلقة ، والعودة إلى أن الفئران قبل الجراحة التنقل.
- علاج الفئران وقت واحد مع البوبرينورفين مسكن (،05-،1 ملغ / كلغ) بعد الجراحة.
- ضمان الفئران ضعف وصول كاف في الغذاء والماء : يتم تركيبها مع زجاجات المياه ينبثق 3.5 بوصة طويلة والفئران التي هي غير قادرة على المشي وتغذية المياه اليد و / أو ذات السعرات الحرارية العالية المكملات الغذائية (نوتري ، كال ، Tomlyn).
7. ممثل النتائج :
وسوف تكون النتائج المرجوة بسبب عدم تحديدها من هروب رأس المال من خلال تعليق خلية الحقن وظهور سليمة من الحبل الشوكي بعد الإجراء. تحقيقا لهذه الغاية ، من المهم جدا أن يكون الإضاءة الساطعة والمباشر على العمود الفقري الماوس خلال الثقب وخلال الحقن. ومما يسهل الإضاءة الأمثل من خلال الإضاءة الألياف البصرية (الشكل 2A).
الشكل 1 -- استئصال الصفيحه (أ) بمجرد عقد بقوة فقرة T9 مع ملقط غريف ، (B ، C) درجة في العمود الفقري مع مشرط وبين T10 T11 لتسهيل دخول المقص الصغير. (D) الشريحة بعناية المقص الصغير من خلال المسافة بين T10 T11 و (السهام وأقحم E ،) وقطع السويقات على كل جانب (شرطات ، E) لتحرير الصفيحة الظهرية. (F) اقلب الصفيحة حتى rostrally وقطع تشغيله.
الشكل 2. حقن NSCs (A) والإعداد العام للmicromanipulator مع مرقئ عقد الماوس تعلق على ذراعه اليسرى والمحاقن هاميلتون على ذراعه اليمنى بزاوية 70. (ب) ومرقئ عقد العضلات الظهرية النخاعي من العمود الفقري الذي يربط T8 و T9. (C) هو خفض الإبرة من خلال روكان خط الوسط في المادة الرمادية في نصف الكرة الآخر ، الأقرب إلى القناة المركزية.
الشكل 3. الغرز وإغلاق الجرح. (أ) تطبق على الخيوط اللفافة السطحية على جانبي الشق. (ب) واقفل شق 2-3 مع المواد الغذائية حسب الحاجة (واحدة أساسية معروضة على الجرح يحتاج 3).
Discussion
وسوف تنفذ جيدا زرع يتوقف في المقام الأول على استئصال الصفيحه الحذر وحقن الخلايا. في شرك الأولية لتجنب خلال الثقب هو إلحاق أضرار في الحبل الشوكي. وهذا يمكن أن تحدث أثناء العملية نفسها أو الأضرار الناجمة عن شظايا عظام حادة تركوها وراءهم بعد الإجراء. لتجنب هذه ، تأكد من أن نقطة من المقص الصغير منحني تواجه دائما بعيدا عن الحبل وتدرس بعناية laminectomized العمود الفقري لضمان أن يتم مسح جميع شظايا العظام والتي تبقى العمود الفقري لهيكل لا يملك جاحظ علنا أو خشنة الحواف.
كما ذكر سابقا ، فإن الكشف عن هروب رأس المال إذا كان من الممكن على ضوء مشرقة زاهية ومباشرة على تعرض النخاع الشوكي أثناء الحقن. هروب رأس المال هو ما سيحدث على الأرجح مع الإبر قياس 30 (مقابل 33 مقياس) وإذا تم حقن بسرعة كبيرة. رغم أن هذا البروتوكول قد أعطانا نتائج جيدة ، وأفاد آخرون ينتظرون فترات طويلة (تصل إلى 5 دقائق) قبل حقن ابرة التراجع 8،9 التالية. أيضا ، والإبر أصغر قياس هي الأفضل ، لكننا لاحظنا أن يتم بسهولة lysed بعض الخلايا عند تمرير عن طريق إبر عيار 33.
لتعظيم الكفاءة ، وفريق زرع يحرسون مراكز الأربعة المختلفة (الماوس الإعدادية ، الثقب ، والحقن ، وخيوط) أمر مرغوب فيه. وعلاوة على ذلك ، ينبغي أن يكون الأمثل لتوقيت كل إجراء لتقليل الوقت الخلايا ينتظرون على الجليد. على سبيل المثال ، ونحن لدينا زرع الفئران في مجموعات من أربعة (عدد الجرعات في كل حمولة من الحقنة) ، والشخص حقن الخلايا يبدأ تحميل محقنة بعد laminectomized الماوس الشخص الثالث واعداد الفئران يجب تخدير التالية وقد laminectomized المجموعة بعد الماوس الثانية من المجموعة السابقة. بهذه الطريقة ، يمكننا زرع الخلايا (أو وسائط التحكم) إلى 40 في الفئران نحو 3 ساعات على الرغم من كل الماوس سيستغرق 30-40 دقيقة تقريبا.
العلاجات البديلة للخلايا لعلاج بعض اضطرابات الجهاز العصبي المركزي في الوقت الراهن 10 في التجارب السريرية. ليس هناك بديل عن النماذج الحية في زرع مجلس الأمن القومي وبروتوكول لدينا من engraftment NSCs في النخاع الشوكي للفئران مع إزالة الميالين يسببها فيروس يسهل استخدام نموذجا هاما للماجستير ويمكن أيضا أن تتكيف بسهولة مع نماذج أخرى.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketaject | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | NDC 57319-542-02 | |
| Xylazine Hydrochloride | MP Biomedicals | 158307 | |
| Nair | Church & Dwight Co. | ||
| 10 μl Hamilton Syringe w/ Removable needle | Hamilton Co | 7635-01 | |
| Hamilton Needles, 30G or 33 G, ½ inch, 30° bevel | Hamilton Co | 7803-077803-05 | Test the viability of your cells following passage through needles to identify the best gauge to use |
| Micro Scissors | World Precision Instruments, Inc. | 555500S | |
| Small Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11053-10 | |
| Stereotaxic | Kopf Instruments | Model 1772 Universal Holder | |
| Stereotaxic | Kopf Instruments | Model 1773 Electrode Holder | |
| Stereotaxic | Kopf Instruments | Model 902 small animal stereotaxic | |
| Stereotaxic | Kopf Instruments | Model 960 left electrode carrier | |
| Sutures | Ethicon Inc. | 95057-064 | |
| Lactated Ringers | Hospira Inc. | NDC 0409-7953-03 | |
| Staples | Fine Science Tools | 12032-07 | |
| Hemostat | Fine Science Tools | 13010-12 | |
| Scalpels, sizes 10,11 | Fisher Scientific | 268878, 268879 | |
| Sutures | Ethicon Inc. | 1676G | size 5-0, 3/8" circle, 19mm needle, 45cm braided thread |
| Reflex 7 wound clip applicator | Fine Science Tools | 12031-07 | |
| 7mm Reflex wound clips | Fine Science Tools | 12032-07 | |
| Olsen-Hegar needle holder | Fine Science Tools | 12502-12 |
References
- Bergmann, C. C., Lane, T. E., Stohlman, S. A. Coronavirus infection of the central nervous system: host-virus stand-off. Nat Rev Microbiol. 4, 121-132 (2006).
- Weiner, H. L. The challenge of multiple sclerosis: how do we cure a chronic heterogeneous disease. Ann Neurol. 65, 239-248 (2009).
- Fleming, J. O., Trousdale, M. D., Bradbury, J., Stohlman, S. A., Weiner, L. P. Experimental demyelination induced by coronavirus JHM (MHV-4): molecular identification of a viral determinant of paralytic disease. Microb Pathog. 3, 9-20 (1987).
- Totoiu, M. O., Nistor, G. I., Lane, T. E., Keirstead, H. S. Remyelination, axonal sparing, and locomotor recovery following transplantation of glial-committed progenitor cells into the MHV model of multiple sclerosis. Exp Neurol. 187, 254-265 (2004).
- Carbajal, K. S., Schaumburg, C., Strieter, R., Kane, J., Lane, T. E. Migration of engrafted neural stem cells is mediated by CXCL12 signaling through CXCR4 in a viral model of multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 11068-11073 (2010).
- Hardison, J. L., Nistor, G., Gonzalez, R., Keirstead, H. S., Lane, T. E. Transplantation of glial-committed progenitor cells into a viral model of multiple sclerosis induces remyelination in the absence of an attenuated inflammatory response. Exp Neurol. 197, 420-429 (2006).
- Blakemore, W. F., Crang, A. J. Transplantation of glial cells into areas of demyelination in the adult rat spinal cord. , Oxford UP. Oxford. (1992).
- Liu, S. Embryonic stem cells differentiate into oligodendrocytes and myelinate in culture and after spinal cord transplantation. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 6126-6131 (2000).
- Keirstead, H. S. Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitor cell transplants remyelinate and restore locomotion after spinal cord injury. J Neurosci. 25, 4694-4705 (2005).
- Mayor, S. First patient enters trial to test safety of stem cells in spinal injury. BMJ. 341, c5724-c5724 (2010).
