Summary
Die Transplantation von Maus neurale Stammzellen (NSCs) in das Rückenmark von Mäusen mit etablierten Demyelinisierung ist detailliert. Die Vorbereitung der NSCs, die Laminektomie der Brustwirbel 9 (T9), und die Transplantation von NSCs zusammen mit dem Pre-und post-operative Betreuung der Mäuse dargestellt.
Abstract
Mäuse mit dem neurotropen JHM Stamm Maus Hepatitis Virus (MHV) infiziert sind, entwickeln pathologische und klinische Ergebnisse ähnlich wie bei Patienten mit demyelinisierenden Erkrankung Multiple Sklerose (MS). Wir haben die Transplantation von NSCs in das Rückenmark von kranken Mäusen führt zu einer signifikanten Verbesserung sowohl Remyelinisierung und in klinischen Ergebnisse gezeigt. Zellersatztherapien für die Behandlung von chronischen neurologischen Erkrankungen sind heute Realität, und in-vivo-Modelle sind von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen den transplantierten Zellen und Wirtsgewebe Mikroumgebung. Diese Präsentation stellt eine angepasste Methode zur Transplantation von Zellen in das Rückenmark von JHMV-infizierten Mäusen. In Kürze stellen wir ein Verfahren für die i) Vorbereitung der NSCs vor der Transplantation, ii) pre-operative Betreuung von Mäusen, iii) Exposition des Rückenmarks über Laminektomie, iv) stereotaktische Injektion von NSCs und iv) die postoperative Versorgung .
Protocol
1. Vorbereitung
- Bereiten Xylazin-Ketamin-Lösung (Ketamin ist eine kontrollierte Substanz. Detaillierte Aufzeichnungen aufzubewahren und Lösungen in einem sicheren, verriegelten Position gespeichert).
- Reinigen und zu sterilisieren Ausrüstung.
- Bereiten OP-Bereich durch Abwischen mit aseptischen Agent und dann Abdecken mit sterilen Papiertuch, und richten Sie den Mikromanipulator.
2. Vorbereitung der Zellen für die Transplantation
- Cells zu einer Konzentration von 100.000 Zellen / É l sollte resuspendiert werden, und obwohl nur 250.000 Zellen pro Maus transplantiert werden, ist ein Überschuss von Zellen für die Spritze loading Zwecke (Vorbereitung mindestens 300.000 Zellen pro Maus empfängt Zellen) benötigt.
- Wash Zellen transplantiert 3 mal in HBSS in einem 50 ml konischen Röhrchen. Zählen Sie die Zellen vor der endgültigen Spin.
- Nach der letzten Spin-Down, dekantieren HBSS und lassen Fläschchen in umgekehrter Lage zu Tröpfchen vom Erreichen der Pellets zu verhindern.
- Dry Innenwände mit einer UV-Bestrahlung, sterile Kimwipe. Lassen Sie die Pellets zu trocknen.
- Halten Sie die Tube aufrecht, langsam und sehr zart die Zellen in die Hälfte der letzten gewünschte Volumen HBSS.
- Messen Sie das Gesamtvolumen durch Pipettieren der Mehrheit der Suspension in einer Pipettenspitze und dann die Anpassung der Regler an der Pipette, bis die gesamte Suspension wird in der Pipettenspitze. Dies wird Ihnen sagen, wie viel mehr HBSS ist für die gewünschte Konzentration benötigt.
- Bringen Sie Lautstärke auf den gewünschten Betrag, indem HBSS.
- Legen Sie wieder auf dem Eis. Überprüfen Sie die Lebensfähigkeit von Zellen, wenn sie auf dem Eis nicht länger als 2 Stunden sein müssen.
3. Vorbereitung der Mäuse für Chirurgie und Transplantation
- Anesthetize der Maus durch intraperitoneale Injektion von Ketamin (100mg/kg) und Xylazin (10mg/kg) in ~ 100 ul Dosen oder eine gleichwertige Betäubung. Der gesamte Vorgang von der chirurgischen Vorbereitung auf Nähen dauert 30-40 Minuten.
- (Optional: apply nummeriert, farbiges Klebeband um den Schwanz jeder Maus, um die Identifizierung zu gewährleisten)
- Shave Bereich der Brustwirbelsäule der Maus aus dem unteren Rücken an den Hals, und sich 2 cm bilaterale von der Mittellinie, mit elektrischen Haarschneider. Das Haar sollte so nah wie möglich geschnitten werden (es kann notwendig sein, über den Bereich gehen mehrmals).
- So entfernen Sie das restliche Haar, eine dünne Schicht von Enthaarungscreme (Nair) mit einem Gaze-Applikator.
- Nach 1-2 Minuten, wischen Nair off mit Gaze leicht mit Seifenwasser benetzt. Die vorbereitete Fläche sollte sauber nackte Haut ohne jede streunende Stück Haar, das in die Wunde während der anschließenden Operation konnte.
Sterilisieren Sie die vorbereitete Fläche mit Jodid-Lösung.
4. Laminektomie
- Häufig verändern und / oder sterilisieren Handschuhe während des gesamten Verfahrens. Bewegen Sie die Maus Rückenseite mit Kopf nach links (wenn Sie Rechtshänder sind). Drape Tier, um die Sterilität zu gewährleisten und dass nur die rasierte Fläche ausgesetzt ist. Machen Sie einen vertikalen Schnitt (~ 1.3cm) über die laminecomy site es mit rund Brustwirbel T8 bis T12.
- Mit dem Graefe Zange in der linken Hand gehalten, fest Sicherung der Wirbelsäule bei T9 (Abbildung 1A) und heben Sie die Maus bis zur Krümmung der Wirbelsäule zu übertreiben.
- Verwenden Sie das Skalpell an der Kreuzung zwischen T10 und T11, der Raum zwischen den beiden stacheligen Erhebungen des Gastes. Weitere Setzen Sie die Kreuzung durch eine sorgfältige Verschrottung der Muskelschicht weg bis auf die Knochen freizulegen (siehe Abbildung 1B, C).
- Verwenden Sie die Schere, um klare Muskel vom Lamina und um den Stiel mit kleinen Scheren weiter. Dies eröffnet eine kleine Lücke zwischen den Wirbeln. Langsam und vorsichtig fügen Sie ein Blatt der Schere in diese Lücke und snip den Stiel. Achten Sie darauf, die Krümmung der Schere immer ist seitlich positioniert, weg von der Steckdose. Wiederholen Sie dies auf der anderen Seite. (Siehe Abbildung 1D, E)
- Heben Sie die Lamina, um die Schnur zu entlarven und sorgfältig snip es ab. Achten Sie darauf, keine freie oder gezackte Knochenfragmente hinter sich zu lassen. (Siehe Abbildung 1F)
- Vor der Injektion, sauber kein Blut entfernt mit einem sterilen Wattestäbchen.
5. Die Injektion von Zellen
- Befestigen Sie die Nadel mit Nadel Mutter, die Hamilton-Spritze und reinigen Sie diese durch Spülen mehrmals mit Wasser, dann 70% Ethanol und schließlich HBSS. Legen Sie nach jedem Kolben mit Wasser füllen, 70% Ethanol oder HBSS.
- Bereiten Sie die Hamilton-Spritze für die Zell-Laden, indem Sie den Kolben und Lösen der Nadel Mutter und zieht die Nadel von der Spritze, um den Gegendruck zu verhindern. Stellen Sie sicher, dass Ihnen der sorgfältige Umgang mit der Nadel und Mutter mit sterilen Handschuhen erfolgen.
- Legen Sie 15μl der Zellen in Pipettenspitze und drücken Sie die Spitze fest in das hintere Ende der Spritze, um die Zellen in die Spritze zu laden.
- Legen Sie den Kolben etwa 5 mm und ziehen Sie dann die Nadel Mutter.
- Drücken Kolben until einige der Zellsuspension sieht ihn aus der Nadel.
- Stellen Sie sicher, es gibt keine Luftblasen in der Spritze und legen Sie die Spritze in die horizontale Position, um die Zellen aus, einen Gradienten durch die Schwerkraft zu verhindern.
- Schnappen Sie der laminectomized Maus durch die spinalis dorsi verbindet die Stacheln von T8 und T9 (Abbildung 2B, C).
- Klemmen Sie die hemostat nach links (vertikal) Mikromanipulator Arm, so dass die Maus Vorderpfoten in der Luft und an seinem hinteren Pfoten leicht berühren eine Plattform von sterilen Papiertüchern wie in den 2A und 2B.
- Bringen Sie die Spritze mit dem rechten Arm Mikromanipulator (bei einer 70 °-Winkel) und schieben Sie die Spritze in die niedrigste Position möglich vor dem Spannen.
- Stabilisieren Sie die Maus durch Pinning seinen Schwanz gegen die Papierhandtücher und langsam wieder in die Spritze (Abb. 2B).
- Senken Sie die Nadel gegen die Schnur und die Nadel 1mm in der gegenüberliegenden Hemisphäre durch die dorsalen Mittellinie (Abbildung 2C). Die Spitze der Nadel in der grauen Substanz in der Nähe des zentralen Kanals werden.
- Langsam injizieren 2.5μl von Zellen. Inject bei einer Rate von 1μl / 5 Sekunden. Nach der Injektion der Zellen, warten Sie 10 Sekunden und Einfahren der Nadel ein Zehntel wiederum zu einer Zeit, alle 10 Sekunden, bis die Nadel heraus ist der Schnur. Achten Sie auf mögliche Abfluss von Zellsuspension.
- Schnell widerrufen die Spritze und entfernen Sie es aus dem Mikromanipulator Arm. Legen Sie die Spritze horizontal.
- Lassen Sie die Maustaste und Transfer zum Nähen Tisch.
- Wiederholen Sie die Schritte 5,7-5,14 für jede Maus, bis die Spritze geleert ist. Sterilisieren Instrumente (in den Sterilisator) und die Nadel (durch Abwischen mit Ethanol) zwischen den Tieren. Discard-Zellen und laden, wenn Verklumpung sichtbar ist.
- Reinigen Sie die Spritze, wie in Schritt 5.1 zwischen den Lasten.
6. Nahtmaterial und post-op Pflege
- Suture den Einschnitt. Suture Nadel in die oberflächliche Faszie auf beiden Seiten des Einschnitts eingefügt. Der Faden wird durch aufgereiht, ziehen Oberflächenfaszie zusammen (Abbildung 3A) und deckt damit die freiliegende Rückenmark an der Stelle entfernt Lamina. Nicht Naht der Hautmuskel an der Haut oder der Skelettmuskulatur des Rückens. Ziehen Sie die gesamte Faden durch, so dass ca. 1 / 2 ". Mit dem Nadelhalter, drei Knoten gebildet und Faden ist so nah an den Knoten wie möglich beschnitten.
- Schließen Sie den Schnitt, indem zwei vor drei Heftklammern (je nach Größe des Einschnitts) auf der Haut (Abbildung 3B). Ziehen Sie die Haut weg von der Maus zu vermeiden Heften die darunter liegende Muskulatur.
- Mit einem 26G3 / 8 Nadel injiziert 0,5 ml Ringer-Laktat-subkutan in den unteren Rücken weg von den Einschnitt.
- Bewegen Sie die Maus zurück in seinen Käfig. Um zu gewährleisten, ist es in der Lage, um bequem atmen, während der Narkose, sollte die Maus auf die Seite in den Käfig gelegt werden, die Vermeidung von Kontakt zwischen der Operationsstelle und Käfig Betten. Käfige sollten auf Heizkissen platziert werden.
- Mäuse überwacht werden nach der Narkose nachlässt, um die Blutung nachlässt gewährleisten, bleiben Nähten verschlossen, und dass Mäuse Rückkehr zur vor der Operation Mobilität.
- Gönnen Mäusen einmal mit der analgetischen Buprenorphin (0,05-0,1 mg / kg) nach der Operation.
- Stellen Sie sicher, beeinträchtigt Mäuse haben einen ausreichenden Zugang zu Nahrung und Wasser: Wasser-Flaschen sind mit verlängerten 3,5-Zoll-Tüllen und Mäuse, die nicht in der Lage sind Hand gefüttert Wasser und / oder hochkalorische Nahrungsergänzungsmittel (Nutri-Cal, Tomlyn) zu Fuß angebracht sind.
7. Repräsentative Ergebnisse:
Gewünschte Ergebnisse werden durch den Mangel an Efflux der Zellsuspension während der Injektion und durch die intakte Erscheinungsbild des Rückenmarks nach dem Verfahren identifizierbar. Zu diesem Zweck ist es unerlässlich, hell und direkte Beleuchtung der Maus über den Rücken bei der Laminektomie und während der Injektion zu haben. Optimale Beleuchtung wird durch Glasfaser-Beleuchtung (Abbildung 2A) erleichtert.
Abbildung 1 - Laminektomie (A) Nach Wirbel T9 ist fest mit dem Graefe Zange gehalten, (B, C) Ergebnis der Wirbelsäule mit dem Skalpell zwischen T10 und T11 eine Aufnahme der Mikro-Schere zu erleichtern.. (D) Schieben Sie die Mikro-Schere durch den Raum zwischen T10 und T11 (Pfeile und Einschub, E) und schneiden Sie die Stiele auf jeder Seite (Striche, E) an der dorsalen Lamina frei. (F) Flip der Lamina bis rostral und hau sie ab.
Abbildung 2. Die Injektion von NSCs. (A) Die allgemeinen Aufbau der Mikromanipulator mit dem hemostat mit der Maus an den linken Arm und der Hamilton-Spritze auf dem rechten Arm in einem 70 Winkel. (B) Die hemostat halten spinalis dorsi verbindet die Stacheln von T8 und T9. (C) Die Nadel wird durch t gesenkter Mittellinie und in der grauen Substanz auf der gegenüberliegenden Hemisphäre, proximal an den zentralen Kanal.
Abbildung 3. Nahtmaterial und Wundverschluss. (A) Die Fäden werden auf die oberflächliche Faszie auf beiden Seiten des Einschnitts angewendet. (B) Der Schnitt wird mit 2-3 Klammern wie nötig (eine Klammer auf eine Wunde braucht 3 dargestellt) geschlossen.
Discussion
Eine gut durchgeführte Transplantation wird in erster Linie davon abhängen, die sorgfältige Laminektomie und Injektion der Zellen. Die primäre Gefahr, die während einer Laminektomie zu vermeiden, ist die Beschädigung des Rückenmarks. Dies kann während des Verfahrens selbst oder durch Schäden, die durch scharfe Knochensplitter hinter nach dem Verfahren nach links auftreten kann. Um diese zu vermeiden, stellen Sie sicher, dass die Punkte der gekrümmten Mikro Scheren sind immer abgewandten Schnur und sorgfältig zu prüfen, die laminectomized Wirbelsäule, um sicherzustellen, dass alle Knochenfragmente geräumt sind und dass die restlichen Wirbelkörper Struktur nicht offen hervorstehende oder gezackte Ränder.
Wie bereits erwähnt, wird die Erkennung von Efflux möglich sein, wenn das Licht hell und Licht auf die freigelegte Rückenmark während der Injektion. Efflux ist am ehesten mit 30-Gauge-Nadeln (gegenüber 33 Gauge) und wenn die Injektion zu rasch erfolgt passieren. Obwohl dieses Protokoll hat uns gute Ergebnisse, andere haben längere Wartezeiten (bis zu 5 Minuten), bevor das Zurückziehen der Nadel nach der Injektion 8,9 berichtet. Außerdem sind kleinere Gauge-Nadeln vorzuziehen, aber wir haben beobachtet, dass einige Zellen zu leicht werden lysiert, wenn bis 33 Gauge-Nadeln weitergegeben.
Um die Effizienz zu maximieren, ist eine Transplantation Team Besatzung der vier verschiedenen Stationen (Maus prep, Laminektomie, Einspritzung und Nähte) wünschenswert. Außerdem sollte der Zeitpunkt für jedes Verfahren optimiert, um die Zeit der Zellen auf Eis warten zu minimieren. Zum Beispiel haben wir unseren Mäusen Transplantation in Gruppen von vier (die Anzahl der Dosen in jedem Laden der Spritze), beginnt die Person die Injektion der Zellen beim Laden der Spritze nach der dritten Maus wurde laminectomized hat und die Person, die die Mäuse sollten die folgenden betäuben Gruppe nach dem zweiten Maus der vorherigen Gruppe wurde laminectomized. Auf diese Weise können wir Zellen (oder Kontrolle media) in 40 Mäuse in ca. 3 Stunden Transplantation, obwohl jeder Maus ca. 30-40 min dauern wird.
Zellersatztherapien für die Behandlung einiger Erkrankungen des ZNS befinden sich derzeit in klinischen Studien 10. Es gibt keinen Ersatz für in vivo-Modellen der NSC-Transplantation und unser Protokoll für die Transplantation von NSCs in das Rückenmark von Mäusen, die mit viralen induzierten Demyelinisierung ermöglicht den Einsatz eines wichtigen Modells der MS und kann auch leicht auf andere Modelle angepasst werden.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketaject | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | NDC 57319-542-02 | |
| Xylazine Hydrochloride | MP Biomedicals | 158307 | |
| Nair | Church & Dwight Co. | ||
| 10 μl Hamilton Syringe w/ Removable needle | Hamilton Co | 7635-01 | |
| Hamilton Needles, 30G or 33 G, ½ inch, 30° bevel | Hamilton Co | 7803-077803-05 | Test the viability of your cells following passage through needles to identify the best gauge to use |
| Micro Scissors | World Precision Instruments, Inc. | 555500S | |
| Small Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11053-10 | |
| Stereotaxic | Kopf Instruments | Model 1772 Universal Holder | |
| Stereotaxic | Kopf Instruments | Model 1773 Electrode Holder | |
| Stereotaxic | Kopf Instruments | Model 902 small animal stereotaxic | |
| Stereotaxic | Kopf Instruments | Model 960 left electrode carrier | |
| Sutures | Ethicon Inc. | 95057-064 | |
| Lactated Ringers | Hospira Inc. | NDC 0409-7953-03 | |
| Staples | Fine Science Tools | 12032-07 | |
| Hemostat | Fine Science Tools | 13010-12 | |
| Scalpels, sizes 10,11 | Fisher Scientific | 268878, 268879 | |
| Sutures | Ethicon Inc. | 1676G | size 5-0, 3/8" circle, 19mm needle, 45cm braided thread |
| Reflex 7 wound clip applicator | Fine Science Tools | 12031-07 | |
| 7mm Reflex wound clips | Fine Science Tools | 12032-07 | |
| Olsen-Hegar needle holder | Fine Science Tools | 12502-12 |
References
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