Summary
Transplantation av mus neurala stamceller (NSCs) i ryggmärgen hos möss med etablerade demyelinisering är detaljerad. Beredningen av NSCs är laminektomi av bröstkotan 9 (T9) och transplantation av NSCs beskrivs tillsammans med pre-och postoperativa vården av möss.
Abstract
Möss infekterade med neurotrop JHM stam av mus hepatit virus (MHV) utveckla patologiska och kliniska resultat liknar patienter med demyeliniserande sjukdom multipel skleros (MS). Vi har visat att transplantation av NSCs in i ryggmärgen av sjuka möss leder till en signifikant förbättring i både remyelination och kliniskt utfall. Cell ersättare terapier för behandling av kroniska neurologiska sjukdomar är nu en realitet och in vivo-modeller är viktiga för att förstå samspelet mellan engrafted celler och värdvävnaden mikromiljö. Denna presentation ger en anpassad metod för att transplantera celler in i ryggmärgen av JHMV-infekterade möss. I korthet erbjuder vi ett förfarande för att i) utarbetande av NSCs före transplantationen, ii) pre-operativ vård av möss, iii) exponering av ryggmärgen via laminektomi, iv) stereotaktisk injektion av NSCs, och iv) postoperativ vård .
Protocol
1. Förberedelser
- Förbered Xylazine-ketamin lösning (Ketamin är ett kontrollerat ämne. Detaljerade poster bör hållas och lösningar som lagras på ett säkert, låst plats).
- Rengör och sterilisera utrustning.
- Förbered operation område genom att torka med aseptisk agent och sedan täcka med steril papper frotté, och ställa in mikromanipulator.
2. Beredning av celler för transplantation
- Celler bör resuspenderas till en koncentration av 100.000 celler / e l, och även om bara 250 tusen celler transplanterade per mus, är ett överskott av celler som behövs för ändamål spruta lastning (Bered minst 300 tusen celler per mus emot celler).
- Tvätta celler som skall transplanteras 3 gånger i HBSS i en 50 ml konisk flaska. Räkna celler innan den slutliga spinn.
- Efter den sista spinn ner, dekantera HBSS och lämna flaskan i upp och ner läge för att förhindra droppar från att nå pelleten.
- Torr inuti väggar med en UV-bestrålat, steril Kimwipe. Låt inte pelleten torka.
- Håll röret upprätt, långsamt och mycket försiktigt resuspendera cellerna i halv önskad slutliga volymen HBSS.
- Mät den totala volymen genom att pipettera majoriteten av suspensionen i en pipettspets och sedan justera ratten på pipetter tills hela suspension i pipettspetsen. Detta kommer att berätta hur mycket mer HBSS behövs för önskad koncentration.
- Ta volymen till önskad storlek genom att lägga HBSS.
- Sätt tillbaka på isen. Kontrollera livskraft av celler, om de måste vara på is längre än 2 timmar.
3. Beredning av möss för kirurgi och transplantation
- Bedöva musen genom intraperitoneal injektion av ketamin (100mg/kg) och xylazin (10mg/kg) i ~ 100 l doser eller motsvarande bedövningsmedel. Hela proceduren från kirurgiska prep att suturering tar 30-40 minuter.
- (Tillval: Applicera numrerade, färgade band till svans av varje musen för att säkerställa identifiering)
- Raka dorsala delen av musen från nedre delen av ryggen till nacken, och förlängning 2 cm bilateralt från mittlinjen med elektriska hårklippningsmaskiner. Håret bör klippas så nära som möjligt (det kan vara nödvändigt att gå över området flera gånger).
- För att ta bort de kvarvarande håret, applicera ett tunt lager av hårborttagning grädde (Nair) med en kompress tippas applikatorn.
- Efter 1-2 minuter, torka Nair av med gasväv fuktad lätt med tvålvatten. Den beredda bör vara rent naken hud utan några herrelösa bitar av hår som kunde komma in i såret under den efterföljande kirurgiska ingreppet.
Sterilisera beredd området med jodid lösning.
4. Laminektomi
- Ofta ändra och / eller sterilisera handskar under hela förfarandet. Placera musen ryggsidan upp med huvudet som pekar åt vänster (om du till höger lämnas). Drape djur för att säkerställa sterilitet och att endast det rakade området utsätts för. Gör ett vertikalt snitt (~ 1.3cm) över laminecomy webbplatsen spännvidd på mellan ryggkotor T8 till T12.
- Med Graefe pincetten hålls i vänster hand, fast säker ryggraden i T9 (Figur 1A) och lyft musen upp att överdriva spinal krökning.
- Använd skalpell att göra mål i korsningen mellan T10 och T11, utrymmet mellan de två taggiga utstickande delar. Ytterligare utsätta korsningen genom att försiktigt skrotning muskeln skiktet bort att exponera ben (se figur 1B, C).
- Använd sax för att ytterligare tydliga muskler bort från lamina och runt BLOMSTJÄLK med små snips. Detta kommer att öppna upp ett litet utrymme mellan kotorna. Långsamt och försiktigt in en kniv i saxen till denna lucka och klipp den BLOMSTJÄLK. Se till krökning av sax, men alltid är placerad i sidled, bort från sladden. Upprepa på andra sidan. (Se figur 1D, E)
- Lyft lamina att exponera sladden och omsorgsfullt klippa bort det. Var noga med att inte lämna några fria eller ojämna benfragment bakom. (Se Figur 1F)
- Före injektion, rent något blod undan med sterila bomullspinnar.
5. Injektion av celler
- Fäst nålen med nålen mutter till Hamilton sprutan och rengör dem genom att spola flera gånger med vatten och sedan 70% etanol, och slutligen HBSS. Sätt kolven efter varje fylla med vatten, 70% etanol, eller HBSS.
- Förbered Hamilton sprutan för cell belastning genom att ta bort kolven och lossa nålen muttern och dra nålen från sprutan för att förhindra mottryck. Se till att noggrann hantering av nål och mutter är klar med sterila handskar.
- Ladda 15μl av celler i pipettspetsen och tryck spetsen tätt i den bakre änden av sprutan för att ladda cellerna i sprutan.
- Sätt kolven ca 5 mm och dra nålen muttern.
- Tryck kolven until en del av cellsuspensionen ses spännande nålen.
- Se till att det inte finns några bubblor i sprutan och lägg ner sprutan i horisontellt läge för att förhindra att cellerna från att göra en gradient av tyngdkraften.
- Ta tag i laminectomized musen genom spinalis dorsi muskel som förbinder ryggar för T8 och T9 (Figur 2B, C).
- Spänn fast hemostat till vänster (vertikal) mikromanipulator arm så att musen framben är i luften och bakbenen lätt att röra en plattform av sterila pappershanddukar som i figurerna 2A och 2B.
- Sätt sprutan på höger mikromanipulator armen (vid en 70 ° vinkel) och skjut sprutan till lägsta möjliga positionen före hopsättning.
- Stabilisera musen genom att fästa svansen mot pappershanddukar och sakta sänka sprutan (Figur 2B).
- Sänk nålen mot sladden och stick in nålen 1 mm i den motsatta halvklotet via dorsala mittlinjen (Figur 2C). Spetsen på nålen ska vara i den grå massan nära den centrala kanalen.
- Injicera långsamt 2.5μl av celler. Spruta med en hastighet av 1μl / 5 sekunder. När du har injicerat celler, vänta 10 sekunder och dra nålen en tiondel av ett varv åt gången var 10 sekunder tills nålen är ur sladden. Var uppmärksam på möjliga utflödet av cellsuspension.
- Snabbt tillbaka på sprutan och ta bort den från mikromanipulator armen. Lägg ner sprutan horisontellt.
- Släpp musknappen och transfer till suturering bord.
- Upprepa steg från 5,7 till 5,14 för varje mus tills sprutan är tömd. Sterilisera verktyg (i autoklav) och nålen (genom att torka med etanol) mellan djur. Kasta celler och ladda om klumpar syns.
- Rengör sprutan som i steg 5,1 mellan laster.
6. Suturer och post-op vård
- Sutur snittet. Suturnålar sätts in i den ytliga fascian på båda sidor av snittet. Tråden är uppträdda genom att dra ytliga fascian tillsammans (Figur 3A), vilket täcker den exponerade ryggmärgen på platsen för borttagna lamina. Inte sutur den kutana muskler bifogas hud eller skelettmuskulaturen av ryggen. Dra hela tråden, lämna ca 1 / 2 ". Med nål, tre knop bildas och tråd är klippta så nära knuten som möjligt.
- Stäng snittet genom att tillämpa 2:58 häftklamrar (beroende på storlek på snitt) mot huden (Figur 3B). Dra försiktigt huden bort från musen för att undvika häftning den underliggande muskeln.
- Med hjälp av en 26G3 / 8 nål injicerar 0,5 ml lakterad Ringerlösning sub-kutant i ländryggen bort från snittet.
- Placera musen tillbaka i sin bur. För att säkerställa det kan andas bekvämt medan under narkos, bör musen placeras på sin sida i buren, undvik kontakt mellan kirurgi webbplatsen och bur sängar. Burarna ska placeras på värmedynor.
- Möss följs upp efter anestesi avtar för att säkerställa blödning avtar, suturer förblir stängd, och att möss som återvänder till innan operation rörlighet.
- Behandla möss en tid med smärtstillande buprenorfin (0,05 till 0,1 mg / kg) efter operation.
- Se till försämrad möss har tillräcklig tillgång till mat och vatten: är vatten flaskor försedda med utvidgade 3,5 tums pipar och möss som inte kan gå för hand matas vatten och / eller kaloririka kosttillskott (Nutri-Cal, Tomlyn).
7. Representativa resultat:
Önskade resultaten skall kunna identifieras av bristen på utflödet av cellsuspensionen under injektionen och den intakta utseendet på ryggmärgen efter ingreppet. I detta syfte är det viktigt att ha ljusa och direkt belysning på musen ryggrad under laminektomi och under injektionen. Optimal belysning underlättas av fiberoptisk belysning (Figur 2A).
Figur 1 - Laminektomi (A) När kota T9 är fast hölls med Graefe pincett, (B, C) poäng ryggraden med skalpell mellan T10 och T11 underlätta för mikro sax.. (D) Skjut försiktigt mikro saxen genom utrymmet mellan T10 och T11 (pilar och infälld, E) och skär pedicles på varje sida (streck, E) för att befria rygg lamina. (F) Vänd på lamina upp rostrally och skär bort det.
Figur 2. Injektion av NSCs. (A) Den allmänna inställningen av mikromanipulator med hemostat håller musen ansluten till vänster arm och Hamilton sprutan på höger arm på en 70 vinkel. (B) hemostat håller spinalis dorsi muskel som förbinder ryggar för T8 och T9. (C) Nålen sänks genom tHan mittlinjen och in i den grå massan på motsatta halvklotet, proximalt till den centrala kanalen.
Figur 3. Suturer och tillslutning av sår. (A) Suturer tillämpas på den ytliga fascian på båda sidor av snittet. (B) Snittet är stängt med 2-3 klammer som behövs (en stapelvara visas på ett sår behöver 3).
Discussion
En väl genomförd transplantation blir beroende främst på den noggranna laminektomi och injektion av cellerna. Den främsta fallgropen att undvika vid ett laminektomi är skadligt för ryggmärgen. Detta kan inträffa under förfarandet självt eller av skador orsakade av vassa benfragment kvar efter förfarandet. För att undvika dessa, se till att punkterna i den böjda mikro saxen alltid är vända bort från sladden och noga undersöka laminectomized ryggraden att säkerställa att alla benfragment tas bort och att resterande ryggraden strukturen inte har öppet utskjutande eller ojämna kanter.
Som tidigare nämnts, kommer att upptäcka utflödet vara möjligt om ljuset skiner starkt och direkt på den exponerade ryggmärgen under injektionen. Efflux är mest sannolikt att hända med 30 gauge nålar (jämfört med 33 gauge) och om injektionen sker för snabbt. Även om detta protokoll har gett oss goda resultat, men andra har meddelat längre väntetider (upp till 5 minuter) innan återgång nålen efter injektion 8,9. Även mindre gauge nålar är att föredra, men vi har konstaterat att vissa celler är för lätt lyseras då passerade 33 gauge nålar.
För att maximera effektiviteten, är en transplantation laget bemannar fyra olika stationer (mus prep, laminektomi, injektion, och suturer) önskvärt. Dessutom bör tidpunkten för varje förfarande optimeras för att minimera tiden cellerna väntar på is. Till exempel, vi transplantationen våra möss i grupper om fyra (antalet doser i varje last av sprutan), börjar personen injicera cellerna lastning sprutan efter den tredje musen har laminectomized och den person som färdigställt möss bör söva följande gruppen efter den andra musen av den tidigare gruppen har varit laminectomized. På detta sätt kan vi transplantera celler (eller kontrollera media) till 40 möss i cirka 3 timmar, även om var och mus tar ca 30-40 min.
Cell ersättare terapier för behandling av vissa sjukdomar i centrala nervsystemet finns för närvarande i kliniska prövningar 10. Det finns ingen ersättning för in vivo-modeller av NSC transplantation och våra protokoll för engraftment av NSCs in i ryggmärgen av möss med virus-inducerad demyelinisering underlättar användningen av en viktig modell av MS och kan enkelt anpassas till andra modeller.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketaject | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | NDC 57319-542-02 | |
| Xylazine Hydrochloride | MP Biomedicals | 158307 | |
| Nair | Church & Dwight Co. | ||
| 10 μl Hamilton Syringe w/ Removable needle | Hamilton Co | 7635-01 | |
| Hamilton Needles, 30G or 33 G, ½ inch, 30° bevel | Hamilton Co | 7803-077803-05 | Test the viability of your cells following passage through needles to identify the best gauge to use |
| Micro Scissors | World Precision Instruments, Inc. | 555500S | |
| Small Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11053-10 | |
| Stereotaxic | Kopf Instruments | Model 1772 Universal Holder | |
| Stereotaxic | Kopf Instruments | Model 1773 Electrode Holder | |
| Stereotaxic | Kopf Instruments | Model 902 small animal stereotaxic | |
| Stereotaxic | Kopf Instruments | Model 960 left electrode carrier | |
| Sutures | Ethicon Inc. | 95057-064 | |
| Lactated Ringers | Hospira Inc. | NDC 0409-7953-03 | |
| Staples | Fine Science Tools | 12032-07 | |
| Hemostat | Fine Science Tools | 13010-12 | |
| Scalpels, sizes 10,11 | Fisher Scientific | 268878, 268879 | |
| Sutures | Ethicon Inc. | 1676G | size 5-0, 3/8" circle, 19mm needle, 45cm braided thread |
| Reflex 7 wound clip applicator | Fine Science Tools | 12031-07 | |
| 7mm Reflex wound clips | Fine Science Tools | 12032-07 | |
| Olsen-Hegar needle holder | Fine Science Tools | 12502-12 |
References
- Bergmann, C. C., Lane, T. E., Stohlman, S. A. Coronavirus infection of the central nervous system: host-virus stand-off. Nat Rev Microbiol. 4, 121-132 (2006).
- Weiner, H. L. The challenge of multiple sclerosis: how do we cure a chronic heterogeneous disease. Ann Neurol. 65, 239-248 (2009).
- Fleming, J. O., Trousdale, M. D., Bradbury, J., Stohlman, S. A., Weiner, L. P. Experimental demyelination induced by coronavirus JHM (MHV-4): molecular identification of a viral determinant of paralytic disease. Microb Pathog. 3, 9-20 (1987).
- Totoiu, M. O., Nistor, G. I., Lane, T. E., Keirstead, H. S. Remyelination, axonal sparing, and locomotor recovery following transplantation of glial-committed progenitor cells into the MHV model of multiple sclerosis. Exp Neurol. 187, 254-265 (2004).
- Carbajal, K. S., Schaumburg, C., Strieter, R., Kane, J., Lane, T. E. Migration of engrafted neural stem cells is mediated by CXCL12 signaling through CXCR4 in a viral model of multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 11068-11073 (2010).
- Hardison, J. L., Nistor, G., Gonzalez, R., Keirstead, H. S., Lane, T. E. Transplantation of glial-committed progenitor cells into a viral model of multiple sclerosis induces remyelination in the absence of an attenuated inflammatory response. Exp Neurol. 197, 420-429 (2006).
- Blakemore, W. F., Crang, A. J. Transplantation of glial cells into areas of demyelination in the adult rat spinal cord. , Oxford UP. Oxford. (1992).
- Liu, S. Embryonic stem cells differentiate into oligodendrocytes and myelinate in culture and after spinal cord transplantation. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 6126-6131 (2000).
- Keirstead, H. S. Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitor cell transplants remyelinate and restore locomotion after spinal cord injury. J Neurosci. 25, 4694-4705 (2005).
- Mayor, S. First patient enters trial to test safety of stem cells in spinal injury. BMJ. 341, c5724-c5724 (2010).
