Summary
De transplantatie van muis neurale stamcellen (NSCs) in het ruggenmerg van muizen met gevestigde demyelinisatie is gedetailleerd. De voorbereiding van NSCs, is de laminectomie van de thoracale wervel 9 (T9), en de transplantatie van NSCs geschetst, samen met de pre-en post-operatieve zorg van de muizen.
Abstract
Muizen die besmet zijn met de neurotrope JHM stam van muizen hepatitis virus (MHV) ontwikkelen pathologische en klinische uitkomsten vergelijkbaar met patiënten met de demyeliniserende ziekte Multiple Sclerose (MS). We hebben aangetoond dat transplantatie van NSC in het ruggenmerg van zieke muizen resulteert in een significante verbetering van zowel remyelinisatie en in de klinische uitkomst. Celvervangingstherapieën voor de behandeling van chronische neurologische ziekten zijn nu een realiteit en in vivo modellen zijn essentieel in het begrijpen van de interacties tussen de cellen en geënt gastheerweefsel micro-omgeving. Deze presentatie geeft een aangepaste methode voor het transplanteren van cellen in het ruggenmerg van JHMV-geïnfecteerde muizen. Kortom, we voorzien in een procedure voor i) de voorbereiding van NSCs voorafgaand aan de transplantatie, ii) de pre-operatieve zorg van muizen, iii) blootstelling van het ruggenmerg via laminectomie, iv) stereotactische injectie van NSCs, en iv) post-operatieve zorg .
Protocol
1. Voorbereiding
- Bereid Xylazine-ketamine oplossing (Ketamine is een gereguleerde stof. Gedetailleerde gegevens worden bewaard en de oplossingen die zijn opgeslagen in een veilige, afgesloten locatie).
- Schoon en steriliseren apparatuur.
- Bereid operatie gebied door af te vegen met aseptische agent en vervolgens bedekken met steriel papier badstof, en het opzetten van de micromanipulator.
2. De voorbereiding van cellen voor transplantatie
- De cellen moeten worden geresuspendeerd tot een concentratie van 100.000 cellen / e l en, hoewel slechts 250.000 cellen worden getransplanteerd per muis, is een overschot aan cellen die nodig zijn voor het laden van spuit doeleinden (voor te bereiden op zijn minst 300.000 cellen per muis het ontvangen van cellen).
- Was cellen worden getransplanteerd 3 keer in HBSS in een 50 ml conische flacon. Tel het aantal cellen voor de laatste spin.
- Na de laatste spin down, giet HBSS en laat injectieflacon ondersteboven positie om druppels te voorkomen dat het bereiken van de pellet.
- Droge binnenmuren met een UV-bestraald, steriele Kimwipe. Sta niet toe dat de pellet drogen.
- Houd de tube rechtop, langzaam en heel subtiel de cellen opnieuw in suspensie in de helft van het uiteindelijke gewenste volume van HBSS.
- Meet het totale volume door pipetteren de meerderheid van de suspensie in een pipetpunt en vervolgens het aanpassen van de draaiknop op de pipetter tot de hele ophanging is in de pipetpunt. Dit zal u vertellen hoeveel meer HBSS is nodig voor de gewenste concentratie.
- Breng het volume op de gewenste hoeveelheid door het toevoegen van HBSS.
- Plaats terug op het ijs. Controleer levensvatbaarheid van de cellen als ze moeten op het ijs te zijn voor langer dan 2 uur.
3. De voorbereiding van muizen voor chirurgie en transplantatie
- Verdoven van de muis door intraperitoneale injectie van ketamine (100mg/kg) en xylazine (10mg/kg) in ~ 100 ul doses of een gelijkwaardige verdoving. De gehele procedure van chirurgische prep te hechten duurt 30-40 minuten.
- (Optioneel: van toepassing zijn genummerd, gekleurde tape om de staart van elke muis om identificatie te garanderen)
- Shave op het ruggedeelte van de muis van de lage rug naar de nek, en de uitbreiding 2 cm bilaterale van de middellijn, met elektrische tondeuse. Het haar moet worden geknipt zo dicht mogelijk (het kan nodig zijn om te gaan over het gebied meerdere malen).
- Voor het verwijderen van de resterende haren, een dunne laag van ontharingscrème (Nair) toe te passen met een gaasje tip applicator.
- Na 1-2 minuten, veeg Nair af met gaas, licht bevochtigd met water en zeep. De bereide gebied moet schoon blote huid zonder enige verdwaalde stukjes van haar dat zou kunnen in de wond te krijgen tijdens de daaropvolgende chirurgische ingreep.
Steriliseer de geprepareerde gebied met jodide-oplossing.
4. Laminectomie
- Regelmatig te veranderen en / of handschoenen steriliseren tijdens de gehele procedure. Plaats de muis dorsale zijde naar boven met het hoofd wijzend naar links (als je rechts bent overhandigd). Draperen dier om steriliteit te waarborgen en dat alleen het geschoren gebied wordt blootgesteld. Maak een verticale incisie (~ 1,3 cm) over de laminecomy website spanning van ongeveer borstwervels T8 naar T12.
- Met de Graefe tang gehouden in de linkerhand, stevig vast de wervelkolom bij T9 (Figuur 1A) en til de muis tot aan de wervelkolom kromming overdrijven.
- Gebruik de scalpel op de kruising tussen de T10 en T11, de ruimte tussen de twee stekelige uitsteeksels score. Verder bloot te leggen van de kruising door het zorgvuldig slopen van de spierlaag weg tot op het bot bloot te leggen (zie figuur 1B, C).
- Gebruik de schaar om duidelijke spieren verder weg van de lamina en rond de pedikel met kleine knipt. Dit opent een kleine ruimte tussen de wervels. Langzaam en voorzichtig steek een blad van de schaar in dit gat en knip de pedikel. Zorg ervoor dat de kromming van de schaar is altijd lateraal geplaatst, uit de buurt van het snoer. Herhaal dit aan de andere kant. (Zie figuur 1D, E)
- Til de lamina aan het snoer bloot te leggen en zorgvuldig knip het uit. Zorg ervoor dat u niet achter te laten een gratis of gekartelde botfragmenten. (Zie Figuur 1F)
- Voorafgaand aan de injectie, weg te reinigen geen bloed met een steriele wattenstaafjes.
5. Injectie van cellen
- Bevestig de naald met naald moer op de Hamilton spuit en maak ze schoon door te spoelen meerdere malen met water, vervolgens 70% ethanol, en uiteindelijk HBSS. Plaats zuiger na elk vullen met water, 70% ethanol, of HBSS.
- Bereid de Hamilton spuit cel laden door het verwijderen van de zuiger en losmaken van de naald moer en trek de naald uit de buurt van de spuit om tegendruk te voorkomen. Zorg ervoor dat de zorgvuldige behandeling van de naald en moer zijn gedaan met steriele handschoenen.
- Load 15μl van cellen in pipetpunt en strak druk op de tip in de achterkant van de spuit om de cellen te laden in de spuit.
- Plaats de zuiger ongeveer 5 mm en draai de naald moer.
- Druk zuiger until een deel van de celsuspensie wordt gezien het verlaten van de naald.
- Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de spuit en leg de spuit in de horizontale positie om de cellen te voorkomen van het maken van een helling door de zwaartekracht.
- Pakken de laminectomized muis door de spinalis dorsi spier het aansluiten van de stekels van T8 en T9 (figuur 2B, C).
- Klem de hemostaat naar links (verticaal) micromanipulator arm, zodat de muis voorpootjes in de lucht en zijn achterste poten lichtjes aanraken van een platform van steriele papieren handdoeken in de figuren 2A en 2B.
- Bevestig de spuit aan de rechterkant micromanipulator arm (bij een 70 ° hoek) en schuif de spuit in de laagste stand mogelijk voor klemmen.
- Het stabiliseren van de muis door pinnen zijn staart tegen het papier handdoeken en langzaam de spuit (figuur 2B).
- Laat de naald naar het snoer en steek de naald 1 mm in de tegenovergestelde hemisfeer via de dorsale middellijn (figuur 2C). De tip van de naald moet in de grijze stof dicht bij het centraal kanaal.
- Injecteer langzaam 2.5μl van cellen. Injecteren met een snelheid van 1μl / 5 seconden. Na het injecteren van de cellen, wacht een 10 seconden en schuif de naald een tiende van een beurt in een tijd elke 10 seconden totdat de naald uit de koord. Besteed aandacht aan mogelijke uitstroom van celsuspensie.
- Snel trekken de spuit en verwijder deze uit de micromanipulator arm. Leg de spuit neer horizontaal.
- Laat de muisknop los en overdracht aan hechten tafel.
- Herhaal stap 5.7-5.14 voor elke muis totdat de spuit leeg is. Steriliseer instrumenten (in de sterilisator) en de naald (door te vegen met ethanol), tussen de dieren. Gooi cellen en reload als klonteren zichtbaar is.
- Reinig de spuit als in stap 5.1 tussen de verschillende vrachten.
6. Hechtingen en post-op zorg
- Hechting van de incisie. Hechtdraad naald wordt ingevoegd in de oppervlakkige fascia aan beide zijden van de incisie. De draad wordt gespannen door, trekken oppervlakkige fascia samen (figuur 3A), waardoor met betrekking tot het blootgestelde ruggenmerg op de site van de verwijderde lamina. Geen hechting van de huid spier aan de huid of de skeletspieren van de rug. Trek de hele draad door, waardoor ongeveer 1 / 2 ". Met de naaldhouder, drie knopen worden gevormd en draad is bijgesneden zo dicht mogelijk bij de knoop mogelijk te maken.
- Sluit de incisie door het toepassen van twee tot drie nietjes (afhankelijk van de grootte van de incisie) naar de huid (Figuur 3B). Trek de huid weg van de muis om te voorkomen dat nieten van de onderliggende spier.
- Met behulp van een 26G3 / 8 naald te injecteren 0,5 ml Ringers lactaat subcutaan in de lage rug uit de buurt van de incisie.
- Plaats de muis terug in zijn kooi. Om ervoor te zorgen dat in staat is om comfortabel te ademen tijdens het onder narcose, de muis moet worden gelegd op zijn kant in de kooi, het vermijden van contact tussen plaats van de operatie en de kooi beddengoed. Kooien moeten worden geplaatst bij verhitting pads.
- Muizen zijn gecontroleerd na verdoving is uitgewerkt om ervoor te zorgen bloeden afneemt, hechtingen gesloten blijven, en dat muizen terug te keren naar pre-operatie mobiliteit.
- Behandel muizen een keer met de pijnstillende buprenorfine (0,05-0,1 mg / kg) na de operatie.
- Zorg ervoor dat verminderde muizen hebben voldoende toegang tot voedsel en water: water flessen zijn voorzien van uitgebreide 3,5-inch uitlopen en muizen die niet in staat zijn om te zijn met de hand gevoed water en / of calorierijke voedingssupplement (Nutri-Cal, Tomlyn) lopen.
7. Representatieve resultaten:
Gewenste resultaten zullen te herkennen zijn door het gebrek aan efflux van de celsuspensie tijdens de injectie en door de intacte verschijning van het ruggenmerg na de procedure. Daartoe is het belangrijk om helder en directe verlichting op de rug van de muis hebben tijdens de laminectomie en tijdens de injectie. Optimale belichting wordt vergemakkelijkt door glasvezel verlichting (Figuur 2A).
Figuur 1 - laminectomie (A) Zodra wervel T9 is stevig gehouden met de Graefe tang, (B, C) de score van de wervelkolom met scalpel tussen T10 en T11 om het invoeren van de micro-schaar te vergemakkelijken.. (D) Schuif de micro schaar door de ruimte tussen de T10 en T11 (pijlen en inzet, E) en snijd de steeltjes aan elke kant (streepjes, E) aan de dorsale lamina gratis. (F) Flip de lamina up rostraal en knip het uit.
Figuur 2. Injectie van NSCs. (A) De algemene opzet van de micromanipulator met de hemostaat houdt de muis aan de linkerarm en de Hamilton spuit op de rechter arm bij een 70 hoek. (B) De hemostat houden de spinalis dorsi spier het aansluiten van de stekels van T8 en T9. (C) De naald wordt verlaagd door middel van tHij middellijn en in de grijze stof aan de andere halfrond, proximaal van de centrale kanaal.
Figuur 3. Hechtingen en wondsluiting. (A) hechtingen worden toegepast op de oppervlakkige fascia aan beide zijden van de incisie. (B) De incisie wordt gesloten met 2-3 nietjes als nodig is (een nietje getoond op een wond nodig 3).
Discussion
Een goed uitgevoerde transplantatie zal vooral afhangen van de zorgvuldige laminectomie en de injectie van de cellen. De primaire valkuil om te voorkomen dat tijdens een laminectomie is de beschadiging van het ruggenmerg. Dit kan gebeuren tijdens de procedure zelf of door de schade veroorzaakt door scherpe botsplinters links achter het volgen van de procedure. Om te voorkomen dat deze, ervoor te zorgen dat de punten van de gebogen micro schaar altijd worden geconfronteerd met uit de buurt van het snoer en zorgvuldig onderzoekt de laminectomized ruggengraat om ervoor te zorgen dat alle botfragmenten worden gewist en dat de resterende vertebrale structuur niet openlijk uitpuilende of gekartelde randen.
Zoals eerder vermeld, zal de detectie van de uitstroom mogelijk als het licht is fel en direct schijnen op de blootgelegde ruggenmerg tijdens de injectie. Efflux is het meest waarschijnlijk gebeuren met 30 gauge naalden (versus 33 gauge) en als de injectie te snel wordt gedaan. Hoewel dit protocol heeft ons goede resultaten, anderen hebben meer gemeld wachttijden (tot 5 minuten) voordat het terugtrekken van de naald na de injectie 8,9. Ook kleinere gauge naalden zijn voorkeur, maar we hebben geconstateerd dat sommige cellen zijn te gemakkelijk gelyseerd toen gepasseerd 33 gauge naalden.
Voor een maximale efficiëntie, een transplantatie team bemannen van de vier verschillende stations (muis prep, laminectomie, injectie, en hechtingen) is wenselijk. Bovendien moet de timing voor elke procedure worden geoptimaliseerd om de tijd de cellen zitten te wachten op ijs te minimaliseren. Zo hebben we onze muizen transplantatie in groepen van vier (het aantal doses in elke lading van de spuit), de persoon die het injecteren van de cellen begint het laden van de spuit na de derde muis is laminectomized en de persoon die de voorbereiding van de muizen zou moeten verdoven van de volgende groep na de tweede muis van de vorige groep is laminectomized. Op deze manier kunnen we transplantatie-cellen (of controle media) in 40 muizen in ongeveer 3 uur, ook al elke muis zal ongeveer 30-40 minuten te nemen.
Celvervangingstherapieën voor de behandeling van sommige aandoeningen CNS bevinden zich momenteel in klinische studies 10. Er is geen substituut voor in vivo modellen van NSC transplantatie en onze protocol voor de innesteling van NSCs in het ruggenmerg van muizen met virale geïnduceerde demyelinisatie vergemakkelijkt het gebruik van een belangrijk model van MS en kan ook gemakkelijk worden aangepast aan andere modellen.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketaject | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | NDC 57319-542-02 | |
| Xylazine Hydrochloride | MP Biomedicals | 158307 | |
| Nair | Church & Dwight Co. | ||
| 10 μl Hamilton Syringe w/ Removable needle | Hamilton Co | 7635-01 | |
| Hamilton Needles, 30G or 33 G, ½ inch, 30° bevel | Hamilton Co | 7803-077803-05 | Test the viability of your cells following passage through needles to identify the best gauge to use |
| Micro Scissors | World Precision Instruments, Inc. | 555500S | |
| Small Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11053-10 | |
| Stereotaxic | Kopf Instruments | Model 1772 Universal Holder | |
| Stereotaxic | Kopf Instruments | Model 1773 Electrode Holder | |
| Stereotaxic | Kopf Instruments | Model 902 small animal stereotaxic | |
| Stereotaxic | Kopf Instruments | Model 960 left electrode carrier | |
| Sutures | Ethicon Inc. | 95057-064 | |
| Lactated Ringers | Hospira Inc. | NDC 0409-7953-03 | |
| Staples | Fine Science Tools | 12032-07 | |
| Hemostat | Fine Science Tools | 13010-12 | |
| Scalpels, sizes 10,11 | Fisher Scientific | 268878, 268879 | |
| Sutures | Ethicon Inc. | 1676G | size 5-0, 3/8" circle, 19mm needle, 45cm braided thread |
| Reflex 7 wound clip applicator | Fine Science Tools | 12031-07 | |
| 7mm Reflex wound clips | Fine Science Tools | 12032-07 | |
| Olsen-Hegar needle holder | Fine Science Tools | 12502-12 |
References
- Bergmann, C. C., Lane, T. E., Stohlman, S. A. Coronavirus infection of the central nervous system: host-virus stand-off. Nat Rev Microbiol. 4, 121-132 (2006).
- Weiner, H. L. The challenge of multiple sclerosis: how do we cure a chronic heterogeneous disease. Ann Neurol. 65, 239-248 (2009).
- Fleming, J. O., Trousdale, M. D., Bradbury, J., Stohlman, S. A., Weiner, L. P. Experimental demyelination induced by coronavirus JHM (MHV-4): molecular identification of a viral determinant of paralytic disease. Microb Pathog. 3, 9-20 (1987).
- Totoiu, M. O., Nistor, G. I., Lane, T. E., Keirstead, H. S. Remyelination, axonal sparing, and locomotor recovery following transplantation of glial-committed progenitor cells into the MHV model of multiple sclerosis. Exp Neurol. 187, 254-265 (2004).
- Carbajal, K. S., Schaumburg, C., Strieter, R., Kane, J., Lane, T. E. Migration of engrafted neural stem cells is mediated by CXCL12 signaling through CXCR4 in a viral model of multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 11068-11073 (2010).
- Hardison, J. L., Nistor, G., Gonzalez, R., Keirstead, H. S., Lane, T. E. Transplantation of glial-committed progenitor cells into a viral model of multiple sclerosis induces remyelination in the absence of an attenuated inflammatory response. Exp Neurol. 197, 420-429 (2006).
- Blakemore, W. F., Crang, A. J. Transplantation of glial cells into areas of demyelination in the adult rat spinal cord. , Oxford UP. Oxford. (1992).
- Liu, S. Embryonic stem cells differentiate into oligodendrocytes and myelinate in culture and after spinal cord transplantation. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 6126-6131 (2000).
- Keirstead, H. S. Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitor cell transplants remyelinate and restore locomotion after spinal cord injury. J Neurosci. 25, 4694-4705 (2005).
- Mayor, S. First patient enters trial to test safety of stem cells in spinal injury. BMJ. 341, c5724-c5724 (2010).
