Summary
Kurulan demiyelinizasyon ile farelerin omurilik içine fare sinir kök hücrelerinin (NSC'lerde) nakli ayrıntılı. NSC'lerde hazırlanması, torasik vertebra 9 (T9) ve NSC'lerde nakli laminektomi farelerde pre-ve post-operatif bakım birlikte özetlenmiştir.
Abstract
Nörotropik JHM suşu (MHV) fare hepatit virüsü ile enfekte Fare demiyelinizan hastalık Multipl Skleroz (MS) olan hastalarda benzer patolojik ve klinik sonuçları geliştirmek. Biz hem remiyelinizasyon ve klinik sonuç önemli bir gelişme hasta farelerin sonuçları omurilik içine NSC'lerde bu nakli göstermiştir. Hücre replasman tedavileri kronik nörolojik hastalıkların tedavisi için artık bir gerçeklik ve in vivo modellerde engrafted hücreleri ve ev sahibi doku mikro-çevre arasındaki etkileşimleri anlamak hayati önem taşımaktadır . Bu sunum adapte JHMV enfekte farelerde omuriliğe hücre nakli için bir yöntem sağlar. Kısacası, biz)) ii, nakli önce) post-operatif bakım farelerde pre-operatif bakım, iii) laminektomi ile omurilik maruz kalma, iv) NSC'lerde stereotaktik enjeksiyon, ve iv NSC'lerde hazırlanması i için bir prosedür .
Protocol
1. Hazırlık
- Xylazine ketamin çözüm (Ketamin kontrollü bir maddedir. Ayrıntılı kayıtları tutulur ve çözümleri, güvenli, kilitli bir yerde muhafaza edilmelidir) hazırlayın.
- Ekipmanı temizleyin ve sterilize edin.
- Aseptik maddesi ile silme ve ardından steril kağıt havlu ile kapsayan cerrahi alanında hazırlayın ve mikromanipülatör kurmak.
2. Hücre nakli için hazırlık
- Fare başına düşen sadece 250,000 hücreleri nakledilen olmasına rağmen hücreler, 100.000 hücre / É l bir konsantrasyon yeniden bekletildi ve olmalıdır, hücrelerin aşırı şırınga yükleme amacıyla hücrelerini aldıktan fare başına en az 300.000 hücre hazırlamak için gereklidir.
- 50 ml konik flakon HBSS içinde 3 kez nakledilen hücrelerin yıkayın. Final spin önce hücreleri saymak.
- Sonra aşağı final spin, süzün HBSS ve damlacıkları pelet ulaşmasını önlemek için konum aşağı ters flakon terk.
- UV-ışınlanmış, steril Kimwipe Kuru iç duvarları. Pelet kurumasına izin vermeyin.
- Yavaş yavaş, tüp dik Holding ve çok ince HBSS yarısı son istenen birimde hücrelerin tekrar süspansiyon haline getirin.
- Bir pipet süspansiyon çoğunluğu pipetleme ve ardından tüm süspansiyon pipet ucu kadar pipetter çevir ayarlayarak toplam hacmi ölçün. Bu ne kadar daha HBSS istenen konsantrasyon için gerekli size söyleyecektir.
- HBSS ekleyerek istenilen miktarda hacim kazandırın.
- Buz üzerinde geri yerleştirin. 2 saat daha uzun buz gerekiyorsa hücre canlılığı kontrol edin.
3. Cerrahi ve transplantasyon için farelerin hazırlanması
- Intraperitoneal ketamin (100mg/kg) ve ksilizin ~ 100 ul dozda (10mg/kg) veya eşdeğer bir anestezik enjeksiyon ile fare anestezisi. Cerrahi hazırlık dikilmesi için tüm işlem 30-40 dakika sürer.
- (Opsiyonel: tanımlanmasını sağlamak için her fare kuyruk numaralı, renkli bant uygulamak)
- Boyun alt sırt fare dorsal bölgede Tıraş ve elektrik kesme makineleri ile ikili orta hatta 2 cm uzanan. Saç (bölge üzerinde birkaç kez gitmek için gerekli olabilir) mümkün olduğunca yakın kesilmelidir.
- Kalan saç kaldırmak için bir gazlı bez ile tüy dökücü krem (Nair) ince bir tabaka uygulayın uçlu bir aplikatör.
- 1-2 dakika sonra, kapalı Nair, sabunlu su ile hafifçe ıslatılmış gazlı bez ile silin. Hazırlanan alan sonraki cerrahi işlem sırasında yara alabilir, herhangi bir saç sokak parçaları olmadan çıplak deri temiz olmalıdır.
Hazırlanan alan iyodür solüsyonu ile sterilize edin.
4. Laminektomi
- Prosedürü boyunca eldiven Sıkça değiştirebilir ve / veya sterilize edin. Kafası (sağ elle) sol işaret fare dorsal tarafına yerleştirin. Kısırlık sağlamak ve sadece traş alana maruz kaldığı hayvan Örtüsü. Laminecomy sitesi T12 hakkında torasik vertebra T8 kapsayan üzerinde dikey bir kesi (1.3cm) olun.
- Sol elinde düzenlenen Graefe forseps ile sıkıca omuriliğe T9 (Şekil 1A), güvenli ve omurga eğriliğinin abartmak için fareyi yukarı kaldırın.
- T10 ve T11 arasında kavşak, iki dikenli çıkıntılar arasındaki boşluğu puan neşter kullanın. Ayrıca kemik açığa çıkarmak için (Şekil 1B, C) dikkatle uzakta kas tabakası hurdaya kavşak maruz kalmaktadır.
- Lamina ve pedikül küçük snips etrafında açık kas daha makas kullanın. Bu omurlar arasındaki küçük bir alan açılacaktır. Yavaş yavaş ve ince makas bu boşluğu içine bir bıçak takın ve pedikül snip. Makas eğriliği her zaman kabloyu uzak, yatay konumlandırılmış emin olun. Diğer tarafta tekrarlayın. (Bkz. Şekil 1D, E)
- Kabloyu maruz lamina kaldırın ve dikkatli bir şekilde kapalı snip. Arkasında herhangi bir ücretsiz veya sivri kemik parçaları bırakmamaya emin olun. (Bkz. Şekil 1F)
- Enjeksiyon için, önce herhangi bir kan steril pamuklu çubukla temizleyin.
5. Hücre enjeksiyonu
- Hamilton şırınga iğne iğne somunu takın ve onlara temiz su, sonra% 70 etanol ile birkaç kez ateş basması, ve nihayet HBSS. Su,% 70 etanol veya HBSS her doldurduktan sonra piston yerleştirin.
- Hamilton şırınga pistonu çıkarmadan ve iğne somunu gevşeterek ve iğne, backpressure önlemek için şırınga uzak çekerek hücre yükleme için hazırlayın. Iğne ve somun dikkatli kullanımı, steril eldiven ile yapılır emin olun.
- Pipet içine hücre 15μl Yük ve ucu şırınganın içine hücreleri yüklemek için şırınga arka ucunu sıkıca basın.
- 5mm hakkında pistonu takın ve ardından iğne somununu sıkın.
- Piston un sıkıptil bazı hücre süspansiyonu iğne çıkmadan görülür.
- Şırınga içinde kabarcıklar vardır ve yerçekimi ile bir degrade hücreleri önlemek için yatay pozisyonda şırınga uzandı emin olun.
- T8 ve T9 (Şekil 2B, C) dikenler bağlayan spinalis dorsi laminectomized fare basılı tut.
- Kelepçe, farenin ön pençeleri havada ve arka pençeleri Şekil 2A ve 2B olarak hafifçe böylece steril kağıt havlu bir platform dokunarak sol (düşey) mikromanipülatör kol hemostat .
- Takın, sağ mikromanipülatör kol (70 ° açıyla) şırınga ve şırınga sıkma önce mümkün olan en düşük pozisyona kaydırın.
- Kağıt havlu karşı kuyruk iğneleyerek ve yavaş yavaş şırınga (Şekil 2B) alt fare sabitleyin.
- Kabloyu doğru iğne Alt ve dorsal orta hat (Şekil 2C) ile ters yarımkürede içine iğne 1mm eklemek . Iğne ucu merkezi kanalına yakın gri cevherde olmalıdır.
- 2.5μl hücrelerin yavaş yavaş enjekte. 1μl / 5 saniye hızında enjekte edilir. Hücreler enjekte ettikten sonra, iğne kablosunun her 10 saniye kadar bir seferde 10 saniye bekleyin ve iğne bir dönüş onda geri çekin. Hücre süspansiyonu mümkün efflux dikkat edin.
- Şırıngaya hızla geri çekin ve mikromanipülatör kolundan ayırmak. Şırınga yatay aşağı yatırın.
- Fare ve dikiş tabloya transfer bırakın.
- Şırınga boşaltılır kadar her fare için 5,7-5,14 adımları tekrarlayın. Araçları (sterilizatör) ve hayvanlar arasındaki iğne (etanol ile silerek) sterilize edin. Hücreler atılır ve topaklanma görülebilir yeniden.
- Yükler arasında adım 5.1 olarak şırınga temizleyin.
6. Dikişler ve post-op bakım
- Kesi dikin. Sütür iğne kesi her iki tarafta yüzeysel fasya içine eklenir. Konu böylece kaldırılır lamina yerinde maruz omurilik kapsayan, (Şekil 3A) birlikte yüzeysel fasya çekerek üzerinden sinirli. , Deri ya da arka iskelet kası bağlı deri kas sütür etmeyin. Iğne tutucu, üç knot oluşan ve iplik düğüm mümkün olduğunca yakın olarak kesilmiş yaklaşık 1 / 2 ". Bırakarak aracılığıyla tüm konu çekin.
- 02:58 zımba (kesi büyüklüğüne bağlı olarak) deri (Şekil 3B) uygulayarak kesi kapatın. Dikkatlice altta yatan kas zımbalama önlemek için fare uzak cilt çekin.
- 26G3 / 8 iğne kullanarak alt kutanöz kesi uzak alt sırt, 0.5 ml Laktatlı Ringers enjekte edilir.
- Kendi kafesine geri koyun fare. Anestezi altında cerrahi sitesi ve kafesli yataklar arasındaki temas kaçınarak, fare, kafese yana yatık olmalıdır süre rahat nefes sağlamak. Kafesler ısıtma pedleri konulmalıdır.
- Anestezi, kanama azalır sağlamak için kapalı giyer sonra Fare izlenir, dikiş kapalı kalır ve bu farelerin ameliyat öncesi hareketlilik dönmek.
- Analjezik buprenorfin (0.05-0.1 mg / kg) aşağıdaki cerrahi ile farelerin bir kez davranın.
- Bozulmuş farelerin yiyecek ve su yeterli erişimi olduğundan emin olun: 3.5 inç emzikli ve elle beslenen su ve / veya yüksek kalorili besin takviyesi (Nutri-Cal, Tomlyn) yürüyemez fareler uzun su şişeleri ile donatılmıştır.
7. Temsilcisi Sonuçlar:
Istenen sonuçları enjeksiyon sırasında hücre süspansiyonu efflux eksikliği ve prosedürü takip omurilik sağlam görünüşü tanımlanabilir olacaktır. Bu amaçla, laminektomi sırasında ve enjeksiyon sırasında farenin omurga üzerinde parlak ve direkt aydınlatma için hayati önem taşımaktadır. Optimal aydınlatma, fiber optik aydınlatma (Şekil 2A) tarafından kolaylaştırılır .
Şekil 1 - Laminektomi (A) Bir omur T9 sağlam puan mikro makas girişini kolaylaştırmak için T10 ve T11 arasında bistüri ile omurga (B, C), Graefe forseps ile tutulur. (D), T10 ve T11 (oklar ve içerlek, E) arasında dikkatlice uzayda mikro makas slayt ve dorsal lamina serbest bırakmak için her iki tarafta pediküller (tire, E) kesmek. (F) rostrally lamina yukarı kaldırın ve kesti.
Şekil 2. NSC'lerde enjeksiyon (A), 70 açıyla sağ kol, sol kol ve Hamilton şırınga bağlı fare tutarak hemostat mikromanipülatör genel kurulum. (B) hemostat, T8 ve T9 dikenler bağlayan spinalis dorsi tutun. (C) iğne, t ile indirilir.o orta hat ve merkez kanalın proksimalinde ters yarımkürede gri madde, içine.
Şekil 3. Dikişler ve yaranın kapanması (A) Dikişler kesi her iki tarafta yüzeysel fasya uygulanır. (B) gerektiği gibi 2-3 zımba ile (3 gereken bir yara üzerinde gösterilen bir elyaf) kesi kapatılır.
Discussion
Iyi uygulanmış bir nakli hücreleri dikkatli laminektomi ve enjeksiyon öncelikle menteşe. Bir laminektomi sırasında önlemek için birincil hatadır omurilik zarar. Bu işlem sırasında veya prosedürü takip geride bırakmış keskin kemik parçaları nedeniyle hasar oluşabilir. Bunları önlemek için, kavisli mikro makas noktaları, her zaman kabloyu uzak bakacak şekilde sağlamak ve tüm kemik parçaları temizlenmiş olduğundan emin olmak için dikkatlice laminectomized omurga incelemek ve kalan vertebral yapısı açıkça çıkıntılı ya da pürüzlü sahip değildir kenarları bu.
Daha önce de belirtildiği gibi ışık enjeksiyon sırasında, parlak ve doğrudan maruz omurilik üzerine parlayan ise, efflux tespiti mümkün olacaktır. Efflux 30 insülin iğnesi (karşı 33 gauge) ve enjeksiyon çok hızlı bir şekilde yapılır gerçekleşmesi en muhtemel. Bu protokol bize iyi sonuçlar vermiş olsa da, diğerleri geri çekilmeden iğne aşağıdaki enjeksiyon 8,9 önce (5 dakika) bekleme süresi uzun bildirdin. Ayrıca, daha küçük ölçü iğneler tercih edilir, ancak 33 insülin iğnesi geçerken bazı hücreler çok kolay parçalanmış olduğunu gözlemledim.
Verimliliği maksimize etmek için, dört farklı istasyonları (fare hazırlık, laminektomi, enjeksiyon ve dikişlerle) personel nakli ekibi arzu edilir. Ayrıca, her bir işlem için zamanlama hücreleri buz üzerinde bekliyor süresini en aza indirmek için optimize edilmelidir. Örneğin, dört (şırınga her yük doz sayısı) gruplar halinde farelere nakli, kişi hücreler enjekte edildikten sonra üçüncü fare laminectomized şırınga yükleme başlar ve farelerin hazırlayan kişi aşağıdaki uyutmak önceki grubun ikinci fare sonra grup laminectomized olmuştur. Bu şekilde, her bir fare yaklaşık 30-40 dakika alacak olsa bile biz yaklaşık 3 saat 40 farelere hücreleri (veya kontrol medya) nakli.
Hücre replasman tedavileri bazı merkezi sinir sistemi bozukluklarının tedavisi için 10 klinik çalışmalarda şu anda. MGK transplantasyonu ve viral kaynaklı demiyelinizasyon MS önemli bir model kullanımını kolaylaştırır farelerin omurilik içine NSC'lerde engraftman için protokol vivo modeller için herhangi bir yerini tutamaz ve aynı zamanda diğer modellere kolayca adapte edilebilir.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketaject | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | NDC 57319-542-02 | |
| Xylazine Hydrochloride | MP Biomedicals | 158307 | |
| Nair | Church & Dwight Co. | ||
| 10 μl Hamilton Syringe w/ Removable needle | Hamilton Co | 7635-01 | |
| Hamilton Needles, 30G or 33 G, ½ inch, 30° bevel | Hamilton Co | 7803-077803-05 | Test the viability of your cells following passage through needles to identify the best gauge to use |
| Micro Scissors | World Precision Instruments, Inc. | 555500S | |
| Small Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11053-10 | |
| Stereotaxic | Kopf Instruments | Model 1772 Universal Holder | |
| Stereotaxic | Kopf Instruments | Model 1773 Electrode Holder | |
| Stereotaxic | Kopf Instruments | Model 902 small animal stereotaxic | |
| Stereotaxic | Kopf Instruments | Model 960 left electrode carrier | |
| Sutures | Ethicon Inc. | 95057-064 | |
| Lactated Ringers | Hospira Inc. | NDC 0409-7953-03 | |
| Staples | Fine Science Tools | 12032-07 | |
| Hemostat | Fine Science Tools | 13010-12 | |
| Scalpels, sizes 10,11 | Fisher Scientific | 268878, 268879 | |
| Sutures | Ethicon Inc. | 1676G | size 5-0, 3/8" circle, 19mm needle, 45cm braided thread |
| Reflex 7 wound clip applicator | Fine Science Tools | 12031-07 | |
| 7mm Reflex wound clips | Fine Science Tools | 12032-07 | |
| Olsen-Hegar needle holder | Fine Science Tools | 12502-12 |
References
- Bergmann, C. C., Lane, T. E., Stohlman, S. A. Coronavirus infection of the central nervous system: host-virus stand-off. Nat Rev Microbiol. 4, 121-132 (2006).
- Weiner, H. L. The challenge of multiple sclerosis: how do we cure a chronic heterogeneous disease. Ann Neurol. 65, 239-248 (2009).
- Fleming, J. O., Trousdale, M. D., Bradbury, J., Stohlman, S. A., Weiner, L. P. Experimental demyelination induced by coronavirus JHM (MHV-4): molecular identification of a viral determinant of paralytic disease. Microb Pathog. 3, 9-20 (1987).
- Totoiu, M. O., Nistor, G. I., Lane, T. E., Keirstead, H. S. Remyelination, axonal sparing, and locomotor recovery following transplantation of glial-committed progenitor cells into the MHV model of multiple sclerosis. Exp Neurol. 187, 254-265 (2004).
- Carbajal, K. S., Schaumburg, C., Strieter, R., Kane, J., Lane, T. E. Migration of engrafted neural stem cells is mediated by CXCL12 signaling through CXCR4 in a viral model of multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 11068-11073 (2010).
- Hardison, J. L., Nistor, G., Gonzalez, R., Keirstead, H. S., Lane, T. E. Transplantation of glial-committed progenitor cells into a viral model of multiple sclerosis induces remyelination in the absence of an attenuated inflammatory response. Exp Neurol. 197, 420-429 (2006).
- Blakemore, W. F., Crang, A. J. Transplantation of glial cells into areas of demyelination in the adult rat spinal cord. , Oxford UP. Oxford. (1992).
- Liu, S. Embryonic stem cells differentiate into oligodendrocytes and myelinate in culture and after spinal cord transplantation. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 6126-6131 (2000).
- Keirstead, H. S. Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitor cell transplants remyelinate and restore locomotion after spinal cord injury. J Neurosci. 25, 4694-4705 (2005).
- Mayor, S. First patient enters trial to test safety of stem cells in spinal injury. BMJ. 341, c5724-c5724 (2010).
