Den zebrafisk njure är hem för både njur-och hematopoetisk stamceller från vuxna / progenitorceller, och representerar ett enastående tillfälle att studera dessa celltyper och deras avkomma i ett ryggradsdjur modell organism. Här visar vi en utförlig dissektion förfarande som gör det möjligt för forskare att identifiera och kirurgiskt ta bort den vuxna zebrafisk njure, som kan användas för applikationer såsom cell isolering, transplantation och studier uttryck för njur-och / eller blod populationer cell.
Forskare som arbetar inom den växande området för vuxna stamcellsbiologi försöka förstå de signaler som reglerar beteende och funktion av stamceller under normal homeostas och stater sjukdom. Förståelsen av vuxna stamceller har bred vittgående konsekvenser för framtiden för regenerativ medicin 1. Till exempel kan bättre kunskap om vuxna stamcellsbiologi underlätta utformningen av behandlingsstrategier, där organ utlöses att läka sig själva eller till och med skapandet av metoder för att odla organ in vitro som kan transplanteras till människor 1. Den zebrafisk har blivit en kraftfull djurmodell för studier av ryggradsdjur cellbiologi 2. Det har varit omfattande dokumentation och analys av embryonal utveckling i zebrafisk 3. Först nyligen har forskare försökt att dokumentera vuxna anatomi och kirurgiska tekniker dissekering 4, eftersom det har skett en progressiv rörelse i zebrafisk samfundet för att bredda tillämpningar av denna forskning organism till vuxenstudier. Till exempel är det växande intresse i att använda zebrafisk att undersöka biologi vuxna populationer stamceller och gör sofistikerade vuxna modeller av sjukdomar som cancer 5. Historiskt sett har isolering av zebrafisk vuxna njur varit avgörande för att studera blodbildningen, eftersom njurarna är den anatomiska belägenhet blodkroppar produktion i fisk 6,7. Njurarna består av nephron funktionella enheter finns i arborized arrangemang, omgiven av hematopoetisk vävnad som är spridda över hela mellanliggande utrymmen. De hematopoetiska komponenten består av hematopoetiska stamceller (HSCs) och deras avkomma som lever i njuren tills de obotligt skilja 8. Dessutom är det nu uppskattat att en grupp av renal stam / progenitorceller (RPC) också bebor zebrafisk njuren orgel och att både njure förnyelse och tillväxt som observerats i andra fiskarter 9-11. I ljuset av denna nya upptäckt är zebrafisk njuren ett organ som rymmer plats för två spännande möjligheter för vuxna biologi stamceller studier. Det är tydligt att många kvarstående frågor mycket väl kan serveras med detta experimentella system. För att uppmuntra expansion av detta område, är det fördelaktigt att dokumentera detaljerade metoder för att visualisera och sedan isolera den vuxna orgeln zebrafisk njure. Detta protokoll detaljer vårt förfarande för dissekering av den vuxna njure från både ofixerade och fasta djur. Dissekering av njuren organ kan användas för att isolera och karakterisera hematopoetisk och njur-stamceller och deras avkomma hjälp av etablerade tekniker såsom histologi, fluorescens aktiverad cell sortering (FACS) 11,12, expression profiling 13,14, och transplantation 11,15. Vi hoppas att spridning av detta protokoll kommer att ge forskare med kunskap för att genomföra en bredare användning av zebrafisk studier som i slutändan kan översättas för tillämpning på människor.
Adulta stamceller är dynamiska och viktiga komponenter som upprätthåller den vuxna kroppen formulär 1. Vuxna stamceller kan också användas för att motverka skador som kroppen ådrar sig vid sjukdomstillstånd och dysfunktion eller förlust av adulta stamceller kan leda till att nedgången av organfunktion och har varit inblandad köra cancer maligniteter och bidra till åldrande. Adulta stamceller uppvisar cellulära egenskaper som skiljer dem från differentierade celltyper. Vid celldelning, vuxna stamceller kan självförnyelse och produktion av stamceller som i sin tur kan ge upphov till olika differentierade avkomma. Det finns ett stort intresse av att förstå de vägar som reglerar de beslut cellen öde och styrka av adulta stamceller på grund av deras viktiga roller i vävnad homeostas 1. Till exempel, många forskare försöker nu identifiera de signaler som upprätthåller olika vuxna populationer stamceller i sin nisch, eller specialiserade mikromiljö, och hur denna nisch påverkas av humorala faktorer.
Vuxna hematopoetiska stamceller (HSCs) är pluripotenta celler som driver kontinuerlig föryngring av blodceller hos djur 8. Hematopoes är en levande process som ständigt pågår under livet av en ryggradsdjur organism eftersom de mogna differentierade blodet celltyper är kortlivade och därför måste fyllas på regelbundet. När de klyftan, HSCs leverera denna viktiga efterfrågan genom att själv förnya och producera en serie av stamceller som ger upphov till erytroida, megakaryocyte, lymfoida och myeloida linjerna. Var och en av dessa typer blodkroppar utför unika funktioner i cirkulationen, bl.a. skall gasväxling på vävnad, ett sätt för tätning skador på blodkärl med hjälp av koagelbildning eller försvarsmekanismer mot invaderande patogener. Medan HSCs har redovisats i många år, en uppsjö av fascinerande frågor förblir obesvarade om dessa fantastiska celler. Nyligen genomförda studier har identifierat subklasser HSCs med olika långsiktiga självförnyelse egenskaper, och klarlägga nisch komponenter och signaler om att modulera HSC beteende 8. Den zebrafisk är nu bland de hörnstenar paradigm blodbildningen forskning, baserad på den genetiska och molekylära egenskaper hos denna djurmodell 8. Forskning utnyttja zebrafisk har lett till nya insikter om HSC biologi som bevaras med högre ryggradsdjur som däggdjur, betonar biomedicinska relevansen av undersökningarna fisk blod 8.
Historiskt har kunskap om HSCs banade väg för expeditioner försöker upptäcka om andra kroppens organ upprätthålls av vuxna stamceller. Många vuxna stamceller är nu uppskattas att existera, allt i olika strukturer från hjärnan till tarmen, huden och skelettmuskulaturen. Fortsatta ansträngningar i stamceller fältet försöka identifiera hur adulta stamceller och även andra differentierade celltyper kan visa förbättrade styrkan i olika miljöer.
Med avseende på njurarna, har det varit stor debatt bland nefrologer om huruvida nedsatt stamceller finns 16. Oberoende fynd har dokumenterat populationer av njure hos däggdjur som har olika grader av regenerativ potential, men en samlad förståelse av dessa rapporter har ännu inte uppnåtts. Intressant, det finns starka belägg för uppfattningen att många fiskarter har celler som klart kan bränslet regenerering av skadad nefroner liksom växer helt nya nefroner i vuxen ålder 9. Senaste arbete har identifierat den molekylära kännetecknen för vuxna celler njure stamceller i zebrafisk 10,11 och visade självförnyelse styrkan hos dessa så kallade nedsatt stam / progenitorceller (RPC) 11. Framtida studier behövs för att avgöra om motsvarande njurceller finns i däggdjur. Kan dock fortsatt utredning om de cellulära och molekylära mekanismer som reglerar fisk RPC ger inblick i hur regenerativ bedrifter kan stimuleras i däggdjur njuren. Det är uppenbart att mycket återstår att förstå om RPC, och att många verktyg nu tillgängliga för zebrafisk forskare kan genomföras för att tackla dessa spännande frågor.
I detta protokoll, beskriver vi vår metod för anatomisk kartläggning och dissekering av den vuxna zebrafisk njuren. Alternativa åtgärder kan användas för att dissekera njurarna, såsom att öppna bukhålan med en ventral snitt med dissektion sax, men vi har stött på det mest framgång i att få tillgång till hela njuren när bukväggen är låst öppen och huvudet är borttaget. Blod och njure forskare såväl som vill isolera och arbeta med dessa typer av celler kan använda antingen dissekeringsmetod. Det bör noteras att den metod vi beskriver för isolering och Working med zebrafisk vuxna njur är definitivt inte begränsad till forskare som vill driva frågor om adulta stamceller biologi, dissektion av detta organ kan underlätta studierna för de forskare utföra undersökningar om ämnen som sträcker sig från fysiologi till åldrandet. Dessutom kan denna metod tillsammans med annan teknik, såsom transgena, så molekylärt att märka och sedan rena och studera diskreta delpopulationer av blod eller njure celler från wildtype eller genetiskt muterade zebrafisk 11. Ser fram emot är sådana detaljerade rening förfaranden av stamceller och stamceller celltyper viktigt att få kunskap om hur deras beteende är reglerad, eftersom operativa tester som transplantation eller stamfader odling utgör grunden med vilken styrka och identitet av dessa celler definieras. Senaste framstegen inom hematopoetiska metoder stamceller kultur öppnar många nya vägar för studier, och kan anpassas till odling av nedsatt populationer 17. Zebrafisk kemisk genetik har varit framgångsrika i att identifiera vägar som modulerar HSCs och nedsatt stamceller i olika sammanhang 18-20, och kommer att fortsätta att vara en bra väg att testa i kombination med ovanstående tekniker cellbiologi. Sammantaget har det funnits ett antal banbrytande bidrag till inom hematologi och nefrologi med zebrafisk-modellen, och fortsatt forskning inom dessa arenor lovar att utöva ytterligare omvälvande insikter under de kommande åren.
The authors have nothing to disclose.
RAW tackar medlemmar Zon och Davidson forskningslaboratorier för sina otaliga bidrag att bidra till att utveckla strategier som successivt har format denna dissektion tekniken i vuxen zebrafisk under det senaste decenniet. Dessutom vill vi uttrycka vår tacksamhet till de anställda i Notre Dame Centrum för Zebrafish forskning för att ge utmärkt pågående djurhållning hand om våra zebrafisk koloni. RAW samlat forskningsanslag från NIH-NIDDK beviljande av bidrag DK083512, och generösa laboratorium startbidrag från University of Notre Dame.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
Dissection scissors | Roboz | RS-5882 |
Dissection forceps | Roboz | RS-5010 |
Dissection angled forceps | Roboz | RS-5058 |
Tricaine | Sigma | E10521 |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 19210 |