Mutagenese und Analyse von genetischen Mutationen in den GC-reichen KISS1 Rezeptor-Sequenz in Menschen mit Fortpflanzungsstörungen Identified
Summary
Mutationen in den kisspeptin Rezeptor (KISS1R) sind mit reproduktiven Störungen bei Patienten assoziiert. Hier beschreiben wir, wie Mutationen der Interesse an der GC-reiche Sequenz von KISS1R sowie die Verwendung von KISS1R Konstrukte einzuführen, um die Abbauweg des Rezeptors durch Immunpräzipitation und Western-Blot charakterisieren
Abstract
Die kisspeptin Rezeptor (KISS1R) ist ein G-Protein-gekoppelten Rezeptor als Auslöser der Pubertät und ein Regulator des reproduktiven Kompetenz im Erwachsenenalter 1,2,3 anerkannt. Inaktivierende Mutationen in KISS1R bei Patienten identifiziert haben mit iodiopathic Hypogonadismus (IHH) 1,2 und vorzeitiger Pubertät 4 wurde verbunden. Funktionelle Untersuchungen dieser Mutanten sind entscheidend für unser Verständnis der Mechanismen der Regulation der Fortpflanzung durch diesen Rezeptor als auch die Gestaltung der Krankheitsverläufe, die sich aus abnormen KISS1R Signalisierung und Funktion. Allerdings macht der hohe GC-reiche Sequenz des Gens KISS1R es ziemlich schwierig zu Mutationen einzuführen oder zu verstärken Gen für diesen Rezeptor durch PCR.
Hier beschreiben wir eine Methode, um Mutationen von Interesse in diesem sehr GC-reiche Sequenz, die verwendet wurde erfolgreich zu generieren mehr als ein Dutzend KISS1R Mutanten in unserem Labor einzuführen. Wir haben die PCR-Bedingungen optimiert, um die Verstärkung von einer Reihe von KISS1R Mutanten, die Substitutionen, Deletionen oder Insertionen in der KISS1R Sequenz enthalten erleichtern. Die Zugabe eines PCR-Enhancer-Lösung, sowie ein kleiner Prozentsatz von DMSO wurden besonders hilfreich, um Verstärkung zu verbessern. Dieses optimierte Verfahren kann sinnvoll sein, für andere GC-reiche Templates als auch.
Der Expressionsvektor kodiert KISS1R ist benutzt worden, um Signalisierung und Funktion dieses Rezeptors zu charakterisieren, um zu verstehen, wie Mutationen können KISS1R Funktion zu ändern und zu den damit verbundenen reproduktiven Phänotypen. Dementsprechend können mögliche Anwendungen KISS1R Mutanten durch Mutagenese erzeugt durch viele Studien 1,4,5,6,7,8 dargestellt werden. Als Beispiel hat das gain-of-function-Mutation in der KISS1R (Arg386Pro), die mit vorzeitiger Pubertät verbunden ist, gezeigt worden, um die Reaktionsfähigkeit des Rezeptors an Ligand Stimulation 4 sowie zu verlängern, um die Geschwindigkeit des Abbaus von KISS1R 9 verändern . Interessanterweise zeigen unsere Studien, dass KISS1R durch das Proteasom degradiert wird, im Gegensatz zu den klassischen lysosomalen Abbau für die meisten G-Protein gekoppelte Rezeptoren 9 beschrieben entgegen. In dem hier vorgestellten Beispiel wird der Abbau der KISS1R in humanen embryonalen Nierenzellen (HEK-293) transient exprimierenden Myc-markierten KISS1R (MycKISS1R) untersucht und behandelt mit Proteasom-Inhibitoren oder Lysosom. Zelllysate werden immunpräzipitiert mit einem Agarose-konjugierten anti-myc-Antikörper durch Western-Blot-Analyse. Detektion und Quantifizierung von MycKISS1R auf Blots erfolgt mit dem LI-COR Odyssey Infrarot-System. Dieser Ansatz kann in der Studie der Abbau anderer Proteine von Interesse als auch nützlich.
Protocol
Discussion
Die ortsspezifische Mutagenese wurde verwendet, um Protein-Funktion durch die Einführung von Nukleotid-Veränderungen in der kodierenden Sequenz von gezielten Gene für mehr als drei Jahrzehnten zu studieren. Die ursprüngliche Technik wurde 1978 von dem britisch-kanadische Chemiker und Nobelpreisträger Michael Smith 10 beschrieben. Michael Smith gemeinsam die 1993 den Nobelpreis für Chemie mit Kary Mullis, der amerikanische Biochemiker, der die Polymerase Chain Reaction (PCR) 11 erfunden. Die u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Und von der Charles H. Hood Foundation Young Investigator Child Health Research Award (Boston, MA) – Diese Arbeit wurde teilweise durch die Reproduktionsmedizin Abteilung der National Institute of Child Health and Human Development (R21 HD059015 NICHD) finanziert.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| 10x PCRx Enhancer Solution | Invitrogen | 52391 |
| PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase Alternative Detergent | Stratagene | 600385 |
| Dpn-I | New England Biolabs | R0176 |
| XL10-Gold Ultracompetent E. coli cells | Stratagene | 200314 |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 |
| Geneporter Transfection Reagent | Genlantis | T201007 |
| Leupeptin | Calbiochem | 108975 |
| MG132 | Calbiochem | 47491 |
| 10xPBS | Ambion | AM9625 |
| Protease inhibitor cocktail and PMSF | Santa Cruz Biotechnology | Sc-24948 |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 |
| anti-Myc tag (clone 4A6) agarose conjugate | Millipore | 16-219 |
| 2x loading buffer | BioRad | 161-0737 |
| Criterion Tris-HCl precast gel, 4-15% gradient | BioRad | 345-0028 |
| Immobilon-FL PVDF membrane | Millipore | IPFL00010 |
| Odyssey Blocking Buffer | LI-COR Biosciences | 927-40000 |
| 10xTBS | BioRad | 170-6435 |
| Rabbit anti-myc antibody | Cell signaling | 2272 |
| Goat anti-rabbit IRDye 800CW | LI-COR Biosciences | 926-32211 |
| Odyssey Imaging Infrared System | LI-COR Biosciences | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) | Thermo Scientific | 78430 |
References
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