Summary
Мутации в kisspeptin рецепторов (KISS1R) связаны с репродуктивные расстройства у больных. Здесь мы опишем, как ввести мутации интереса к GC-богатые последовательности KISS1R, а также использование конструкций KISS1R охарактеризовать путь деградации рецептора иммунопреципитации и иммуноблоттинга
Abstract
Kisspeptin рецепторов (KISS1R) является G-белком рецептор признан курок полового созревания и регулятором репродуктивной компетенции в зрелом возрасте 1,2,3. Инактивирующих мутаций в KISS1R идентифицированы у пациентов были связаны с iodiopathic гипогонадотропный гипогонадизм (IHH) 1,2 и преждевременным половым созреванием 4. Функциональные исследования этих мутантов имеют решающее значение для понимания механизмов, лежащих в регуляции размножения этим рецептором, а также теми, кто определяет болезнь результаты, которые получаются в результате ненормального сигнализации KISS1R и функции. Тем не менее, высоко GC-богатые последовательности гена KISS1R делает его довольно трудно представить мутации или усиливать ген, кодирующий этот рецептор с помощью ПЦР.
Здесь мы опишем метод введения мутаций интерес в этой весьма GC-богатые последовательности, которые были успешно использованы для создания более десятка KISS1R мутантов в нашей лаборатории. Мы оптимизировали ПЦР условия для облегчения усиления спектр KISS1R мутантов, которые включают замены, делеции или вставки в последовательности KISS1R. Помимо решения ПЦР усилитель, а также небольшой процент ДМСО были особенно полезны для улучшения усиления. Такая оптимизированная процедура может быть полезным для других GC-богатых шаблонов, а также.
Выражение вектора, кодирующего KISS1R это использовалось для характеристики сигнализации и функции этого рецептора для того, чтобы понять, как мутации могут менять KISS1R функции и привести к репродуктивным связанных фенотипов. Соответственно, возможности применения KISS1R мутантов порожденных сайт-направленного мутагенеза можно проиллюстрировать многими исследованиями 1,4,5,6,7,8. Как, например, получить-функции мутации в KISS1R (Arg386Pro), что связано с преждевременным половым созреванием, как было показано, чтобы продлить реагирования рецептора лиганда стимуляции 4, а также изменять скорость деградации KISS1R 9 . Интересно, что наши исследования показывают, что KISS1R разлагается под протеасомы, в отличие от классического лизосомальных деградации описаны для большинства G-белком рецепторы 9. В примере, приведенном здесь, деградация KISS1R исследуется в человеческих эмбриональных клеток почки (HEK-293) временно выражения Myc с метками KISS1R (MycKISS1R) и обрабатывают протеасом или лизосомы ингибиторов. Сотовые лизатов являются иммунопреципитации использованием агарозы-сопряженных анти-Myc антител с последующим анализом пятно западной. Обнаружение и количественное определение MycKISS1R на пятна осуществляется с помощью LI-COR Odyssey Инфракрасная система. Такой подход может быть полезным при изучении деградации других белков интерес.
Protocol
1. Сайт-направленный мутагенез высоко GC-богатых последовательностей гена KISS1R
- Шаблон: полная кДНК последовательность человека KISS1R с Myc-теги, слитый с его N-конца. Эта последовательность клонировали в выражении pCS2 + вектор, который совместим с клеточных линий млекопитающих затем используется для трансфекции. Это выражение вектора называются в этом документе pCS2 + Myc KISS1R.
- Грунтовка дизайн: грунтовки предназначены для перевозки желаемых мутаций, в соответствии с инструкциями Quikchange сайт-направленного мутагенеза комплект (Stratagene). В итоге:
- Оба (прямого и обратного) праймеров должен содержать желаемые мутации и отжига в той же последовательности на противоположных нитей плазмиды (например, прямого и обратного праймеров дополняют друг друга)
- Грунтовка должна быть от 25 до 45 баз долгой и закончится в один или несколько С или G баз
- Представленный мутации (ы) должны быть в середине грунтовки и в окружении ~ 10-15 основы правильной последовательности с обеих сторон
- Температура плавления (Tm) праймеров должна быть равна или превышает 78 ° C. Используйте следующие формулы для оценки Tm:
- При внедрении мутаций: Тт = 81,5 + 0,41 (% GC) - 675 / N -% несоответствия (N является грунтовка длиной в базах)
- При внедрении вставки или удаления: Тт = 81,5 + 0,41 (% GC) - 675 / N (N не включает в себя основания, которые вставляются или удаляются)
- Используйте обессоленной праймеров (не далее очищения необходимо).
- Оба (прямого и обратного) праймеров должен содержать желаемые мутации и отжига в той же последовательности на противоположных нитей плазмиды (например, прямого и обратного праймеров дополняют друг друга)
- Лучшие условия усиления включают добавление PCRx Enhancer решение (Invitrogen) и ДМСО. По крайней мере, 2 концентрации ДМСО, например, 4% и 8%, должны быть проверены. Условия ПЦР приведены в таблице и на рисунке 1, а результаты представителя ПЦР из pCS2 + MycKISS1R показано на рисунке 2.
- Ликвидация родительской ДНК на усиление продуктов переваривания метилированной ДНК с ДПНИ в течение 1 ч 30 мин при 37 ° С: смешайте в 17.5μl центрифуге трубки продуктов ПЦР с 2μl 10х NEBuffer 4 и 0.5μl ДПНИ (10U; Новой Англии Биолабс).
- Преобразование ДПНИ обработанных продуктов ПЦР: смешайте 2μl ДПНИ обработанной ДНК с 45μl из XL10-Gold Ultracompetent Е. палочка (Stratagene) в предварительно охлажденные 15 мл трубки культуре клеток. Добавить 2μl из β-меркаптоэтанол и следуйте инструкциям Stratagene. Пластина 100-400μl трансформированных бактерий в LB-агаром содержащие 100μg/ml ампициллин и инкубировать при температуре 37 ° C.
- Miniprep от 2 до 4 отдельных колоний, чтобы изолировать ДНК плазмиды. Подтверждение успешного внедрения желаемой мутации путем секвенирования и анализа выделенной ДНК.
2. Переходные трансфекции MycKISS1R в НЕК-293 клетки
- Следующие эксперименты проводятся в человеческих эмбриональных клетках почек (HEK-293) культивировали в инкубаторе CO 2 (5% CO 2) при 37 ° С в DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина / стрептомицина.
- Семенной НЕК-293 клеток на 2.5x10 5 клеток / мл в 6-луночных планшетах, и пусть они растут в течение ночи при 37 ° С до трансфекции. ПРИМЕЧАНИЕ: (я) используют трех экземплярах скважин для каждой экспериментальной состоянии; (II) идеал слияния клетка во время трансфекции составляет 30% -50%.
- Трансфекции НЕК-293 ячеек с помощью реагента GenePorter трансфекции (Genlantis), в соответствии с инструкциями производителя: Смешайте половину бессывороточной DMEM с 0.5μg pCS2 + MycKISS1R плюс 0.5μg контроля (пусто) вектор суммировать 1 мкг ДНК / хорошо. Смешайте другая половина с 10 мкл реагента трансфекции на мкг ДНК трансфекции. ПРИМЕЧАНИЕ: Идеально плазмиды концентрация ДНК может меняться.
3. Лечение клеток и лизис
- 24 часа после трансфекции, замените клеточной среде с 1 мл DMEM, содержащей 2,5% FBS (для уменьшения клеточного метаболизма). ПРИМЕЧАНИЕ: Это снижение в сыворотке может содействовать и / или усилить выявление результатов.
- Добавить лизосомы ингибитора (100μg / лунку Leupeptin) непосредственно в каждую лунку по одной весь 6-луночный планшет. Инкубировать при 37 ° С в течение 6 или 16 часов (или другую нужную раз)
- Добавить свежеприготовленный протеасомы ингибитора (10 мкм / лунку MG132), непосредственно во все лунки двух целых 6-луночных планшетах. Инкубировать при 37 ° С в течение 2, 4, 6 или 16 часов (или желаемого раза). Добавить автомобиля во все лунки четвертого 6-луночного планшета (0 временной точке) и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 16 ч
- При инкубации в течение, перемещение пластины в лед и выполнять всю процедуру лизиса на льду для предотвращения деградации белка:
- Для увеличения выход белка, объединить трем образцам на 6-луночных планшетах в одном Centrifuge трубки
- Аспирируйте средних и мыть клетки один раз с 1 мл ледяной фосфатным буферным раствором (PBS)
- Добавить 100 мкл ледяного буфера для лизиса (20 мМ HEPES, рН 7,4, 1% NP-40, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,25% натрия дезоксихолата), содержащий ингибиторы протеазы (1x коктейль содержащих 100mM AEBSF-HCl, 80μM апротинин, 5мм bestatin, 1,5 E-64, 0,5 М ЭДТА, 2 мм и 1 мм leupeptin пепстатина, плюс 2 мМ PMSF) в каждую лунку
- Удалить ячейки с скребок клеток и передачи клеточных лизатов в центрифужные пробирки
- Pass клетки ~ 10 раз в течение 20-иглы. ПРИМЕЧАНИЕ: Не разрушать ультразвуком образцы предназначены для западных обнаружения пятна мембранных белков. Ультразвуком приводит к агрегации мембранных белков, которые не будут мигрировать должным образом во время электрофореза
- Инкубируйте клеточных лизатов в течение 1 ч при температуре 4 ° С на качалке платформы
- Центрифуга клеточных лизатов при 4 ° С в течение 10 мин при 10000 х оборотов в минуту и передачи супернатанты новых труб. ПРИМЕЧАНИЕ: Не беспокоить гранул во время этого шага
- Определение концентрации белка в 10 мкл супернатантов методом BCA (Pierce)
- Развести лизатов на 1mg/ml с лизисом буфер, содержащий ингибиторы протеазы.
4. Иммунопреципитация и иммуноблоттинга обнаружения MycKISS1R
- Выполните следующие шаги иммунопреципитации на льду (или при температуре 4 ° С):
- Вымойте соответствующее количество агарозном-сопряженных анти-Myc антител (2.5μg / образец) два раза в ледяной PBS и добавить это к 400μg лизата белка.
- Иммунопреципитации MycKISS1R на лизаты течение ночи при 4 ° С на качалке платформа с мягкой агитации.
- Спином вниз агарозном бисером импульсным центрифугированием при 4 ° С (до 10000 х оборотов в минуту)
- Аспирацию и отбросить супернатанты (не нарушая пеллет)
- Вымойте бисером раз с ледяной буфера для лизиса и дважды с ледяным PBS. Обратить трубы аккуратно перед спиннинг
- Ressuspend бисером содержащих антиген-антитело MycKISS1R в 2 раза буфером загрузки образца, содержащего 10% β-меркаптоэтанола.
- Иммуноблоттинга из MycKISS1R иммунных комплексов:
- Тепло образцов в течение 30 мин при 37 ° С. ПРИМЕЧАНИЕ: Не кипятите образцы предназначены для западных обнаружения пятна мембранных белков. Как ультразвуком, кипячение также приводит к агрегации этих белков
- Перемещение трубы сразу в лед в течение 5 мин
- Отдельные белков SDS-PAGE в 4-15% градиент геля.
- Трансфер в Immobilon-ФЗ PVDF мембраны (для инфракрасного обнаружения) на 25В в течение 30 минут в передаче буфера (48 мм трис базы, 39мм глицин, 1,2 мм SDS, 20% метанола, рН 9,2) с помощью Bio-Rad полусухого Трансфер аппарат
- Вымойте мембран в течение 5 мин при комнатной температуре с Трис-буферного раствора (TBS) и блокировать в течение 1ч при комнатной температуре с Licor Odyssey блокировка на качалке платформы (в качестве альтернативы, 5% молока в TBS могут быть использованы для блокирования неспецифического связывания).
- Инкубируйте мембран в течение ночи при 4 ° С с кроличьих анти-Myc антител (1:500) в блокирующем растворе, содержащем 0,1% Твин-20
- Удаление первичного антитела и мыть мембраны 3 раза из 5 мин каждая с TBS, содержащем 0,1% Твин-20 (TBST)
- Инкубируйте мембраны в течение 1 ч при комнатной температуре с козьим Инфра-RedDye ® 800CW меченные анти-IgG кролика (1:10000) в блокирующем буфере, содержащем 0,1% Твин-20 и 0,01% SDS
- Удалить вторичными антителами, мыть мембраны 3 раза из 5 мин каждая TBST и в последний раз с TBS только (чтобы удалить остатки твин-20)
- Работа с изображениями и количественная оценка MycKISS1R использовании LI-COR Odyssey инфракрасного тепловизора:
- MycKISS1R на мембранах будет отображаемого использованием LI-COR Odyssey инфракрасного тепловизора. Во-первых, место мембрану на нижнем левом углу Odyssey сканера, совместив его с сеткой. Крышка с резиновым ковриком, сгладить пузыри с роликом и закройте крышку
- Создать новый файл проекта на компьютере. Имя файла, нажмите кнопку "Готово", а затем введите сканер Войти на "сканирование". Размер окна сканера консоль под свои мембраны, а затем выберите 169μm разрешении и средним качеством изображения
- Выберите интенсивности параметров 700 (красный) и 800 (зеленый) каналов в соответствии с ожидаемыми сила каждого сигнала. Это сигнал для целей визуализации только и не будет влиять на количественный. Нажмите кнопку "пуск сканирования"
- Имя и сохранить результат сканирования, затем нажмите кнопку "OK", чтобы открыть его в новом окне для количественной оценки. MycKISS1R мономеров должна быть видна примерно 43kD
- Использование "окно" инструмент (на левой боковой панели), нарисуйте прямоугольник вокруг первой группе. Перетащите рамку вокруг, чтобы убедиться, все диапазоны приспособиться, то "копировать" и "вставить" окно по всем зонам
- Выбрать все ящики с помощью "Ctrl +", а затем выберите опцию вычесть средний фон. Нажмите кнопку "отчет" в верхнем меню и таблицы с количественной величины появятся. Представитель результаты, показанные здесь, represented как раз-увеличение по сравнению с необработанными клетками (нулевое время)
5. Представитель Результаты:
- Сайт-направленный мутагенез высоко GC-богатых последовательностей гена KISS1R:
Таблица 1. Показывает, сочетание реагентов для повышения эффективности KISS1R усиления. Эта комбинация успешно использованы для введения нескольких мутаций направлены против различных регионах KISS1R кДНК последовательности, а также для усиления этой весьма GC-богатых гена. На рисунке 1 показана езда на велосипеде и усиления условий для мутагенеза KISS1R. Эти условия были изменены с QuikChange сайт-направленного мутагенеза комплект (Stratagene).
Рисунок 2. Показывает, представитель результате использования этой оптимизированный протокол. Кроме того на 4% или 8% ДМСО в сочетании с PCRx Enhancer значительно повышает выход усиления GC-богатых KISS1R кДНК содержащие плазмиды. В этом представительном эксперимент, 4% ДМСО при условии, чуть лучшие условия усиления по сравнению с 8% ДМСО. Преобразование ДПНИ обработанных продуктов амплификации с ultracompetent Е. палочка обычно дает от 100 до более 1000 колоний, и, насколько успешным будет внедрение желаемых мутаций составляет 80-90%, как это определено секвенирования ДНК. - Использование конструкции MycKISS1R для изучения физиологии рецепторов:
В этом представительном эксперимент, дикого типа pCS2 + MycKISS1R усиливается в соответствии с оптимизированным протокол, описанный здесь, используется для исследования в естественных условиях KISS1 рецепторов деградации в соответствующую строку ячейки (HEK-293) временно выражения MycKISS1R. После обработки трансфицированных НЕК-293 клеток с лизосомы (leupeptin) или протеасом (MG132) ингибиторы в соответствии с протоколом описаны в методах, клетки лизируют и обрабатываются для западных пятно. Верхней панели На рисунке 3 показана проверка MycKISS1R мономеров в то время как нижняя панель показывает количественное полос показаны на верхней панели. Количественное полос показывает, что ни 6ч ни 16h из leupeptin лечения пострадавших уровней MycKISS1R белка. С другой стороны, лечение MG132 в результате зависящих от времени увеличение MycKISS1R белка в этих клетках, который завершается в 45 раз накопление рецепторов после 16 ч инкубации с MG132. Эти наблюдения показывают, что, в отличие от большинства G-белком рецепторы, KISS1R разлагается под протеасом (а не лизосомы).
| ДМСО | |||
| Реагенты | 0 | 4% | 8% |
| Воды | 35 | 33 | 31 |
| 10x Pfu Ультра Taq буфер | 5 | 5 | 5 |
| дНТФ смеси (10 мм) | 1 | 1 | 1 |
| Грунтовка смысле (25pmol/μl) | 1 | 1 | 1 |
| Грунтовка антисмысловых (25pmol/μl) | 1 | 1 | 1 |
| 10x PCRx Enhancer решения | 5 | 5 | 5 |
| ДМСО | 0 | 2 | 4 |
| Pfu Ультра Taq-полимеразы (2.5U/μl) | 1 | 1 | 1 |
| ДНК плазмиды (20ng/μl) | 1 | 1 | 1 |
Таблица 1. Сочетание реагентов успешно используется для мутировать и усилить GC-богатых KISS1R
Рисунок 1. Велоспорт условий успешного мутагенеза и усиления GC-богатых KISS1R: 2min горячий старт последовал 18 циклов плавления 30 сек при 95 ° С, 1 мин отжига при 55 ° С и 6 мин расширения при 68 ° C. Еще 10 мин расширения при 68 ° C была добавлена в конце последнего цикла. Эти параметры были скорректированы из оригинального протокола мутагенеза QuikChange II XL-сайт-направленного мутагенеза комплект (Stratagene).
Рисунок 2. Визуализация GC-богатых pCS2 + Myc KISS1R усиливается в наличии или отсутствии ДМСО: пять мкл аликвоты pCS2 + Myc KISS1R усиливается в присутствии 0, 4 или 8% ДМСО были погружены в этом представительном 1% агарозном геле, окрашивали этидия метила и визуализируется с помощью УФ света. Плазмиды полос 6Кб видны с обеих полос загружается с продуктами ПЦР усиливается в присутствии 4% и 8% ДМСО, но не на первой полосе, который был загружен ПЦРПродукт усиливаются в отсутствие ДМСО.
Рисунок 3. Влияние leupeptin или MG132 на уровни белка Myc KISS1R в НЕК-293 ячеек: HEK-293 клеток, экспрессирующих Myc KISS1R лечили 100μg/ml leupeptin или 10 мкм MG132 при 37 ° С в течение назначенного времени. Myc KISS1R на 400μg клеточных лизат иммунопреципитации с 2.5μg агарозы-сопряженных анти-Myc антитела и проанализированы иммуноблоттинга. () LI-COR Odyssey обнаружения Myc KISS1R после инкубации иммуноблотов с кроликом анти-Myc-теги антител с последующей инкубацией с IRDye 800CW меченные анти-кролик; (B) Количественная оценка Myc полосы KISS1R показано в (), используя LI-COR Odyssey количественного программного обеспечения. Результаты представлены в виде диван-увеличение по сравнению с необработанными клетками (время 0).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Сайт-направленный мутагенез был использован для исследования функции белка, вводя изменения в нуклеотидной последовательности, кодирующей целевых генов на протяжении более трех десятилетий. Оригинальная методика была описана в 1978 году англо-канадского химик, лауреат Нобелевской премии Майкл Смит 10. Майкл Смит разделил 1993 Нобелевская премия по химии с Кары Маллис, американский биохимик, который изобрел полимеразной цепной реакции (ПЦР) 11. Оригинальный метод описывается Майкл Смит был улучшен за эти годы. Способность вводить мутации, вставки или удаления в нужную последовательность гена в одной реакции ПЦР внесла свой вклад в высокую точность и процент успеха этой процедуры, а также для производства мутантов в относительно короткий период времени.
Несмотря на все технические усовершенствования, мутации и усиления высоко GC-богатых последовательностей генов, таких как KISS1R являются особенно опасными. Размер грунтовки предназначены для мутагенеза высоким содержанием GC последовательности должен быть отрегулирован для размещения GC содержание, таким образом, что температура плавления находится в рекомендуемом диапазоне. Соответственно, грунтовки введения мутаций в KISS1R имеют размеры, имеют температуру плавления между 78 ° -86 ° C. Некоторые из регионов KISS1R гена содержание GC более 85%. Размер праймеры ввести мутации в этих регионах должны быть приведены в соответствие диапазон температуры плавления, упомянутых выше. Грунтовки с температурой плавления выше, что предел не может отделиться при 95 ° С, что отрицательно сказывается усиление. С другой стороны, грунтовки с т ниже, чем 78 ° C с большей вероятностью прикрепляться к усиливать неспецифическую последовательностей.
Кроме того, усиление условий и реагентов оптимизированы для высокого содержания GC последовательность KISS1R. Сочетание 4% ДМСО и решение ПЦР Enhancer от Invitrogen (табл. 1 и рис 2) приводит к увеличению усиления эффективности KISS1R. Кроме того, другие реагенты, такие как бетаин, были успешно использованы для улучшения усиления других GC богатых последовательностей 12,13. Тем не менее, не было никакой заметной положительный эффект бетаина на KISS1R усиления в наших руках. Кроме того, ПЦР усилитель имеющихся решений от других поставщиков могут быть в равной степени способны улучшить усиления GC богатых последовательностей.
Использование оптимизированы настройки, описанные здесь, мы успешно внедрили несколько мутаций в различных регионах KISS1R кДНК, в которую вошли до 6 нуклеотидных изменений сразу (осуществляется по той же грунтовки) и удаление до 27 нуклеотидов. Преобразование этих мутантов порожденных от сотен до тысяч колонии с высокой (80-90%) скорость колонии, содержащие правильной последовательности мутантов подтверждается секвенирования ДНК.
Сайт-направленный мутагенез также может быть использован для добавления антигенной теги, такие как Myc или флага к амино-или карбоксильные концом белков. Эти теги позволяют для селективного иммунопреципитации и / или обнаружения белков, и они особенно полезны, когда надежные антител к белку интерес не доступны, как и для KISS1R. В примере, приведенном здесь, кодирования вектора экспрессии для KISS1R, которая сливается с одиннадцать аминокислот Myc-тегов на своем амино-вокзал (Мой cKISS1R), используется для изучения деградации путь KISS1R в НЕК-293 клеток. Эффективность трансфекции НЕК-293 клеток с Моя cKISS1R используя метод, описанный здесь составляет 25-30%. Таким образом, иммунопреципитации используется, чтобы сосредоточиться Мой cKISS1R из клеточных лизатов тем самым улучшая обнаружения и визуализации рецепторов. Этот подход часто используется для облегчения визуализации белков выразил эндогенно при низких уровнях, а 14.
Важно отметить, что G-белком рецепторы, такие как KISS1R, а также другие мембранные белки, не следует перемешать с помощью ультразвука или вареная, прежде чем гель загрузкой. Хотя эти процедуры, как правило, используется для обработки образцов для иммунопреципитации или иммуноблоттинга, ультразвука и кипения приводит к агрегации белков мембран, нарушая их надлежащее миграции при электрофорезе 15. На самом деле, замена этих процедур с более умеренными гомогенизации, таких как иглы прохода и нижней нагрева образца, например, 37 ° С в течение 30 минут (а не кипящей) необходим для обнаружения KISS1R мономеров.
Иммунопреципитации Мой cKISS1R определяется с помощью тепловизора Odyssey (LI-COR Biosystems) после инкубации пятна с инфракрасным красителя конъюгированных вторичных антител. Преимущества этой системы включают в себя поддержание сильного сигнала, которые могут быть обнаружены с высокой точностью в течение нескольких месяцев, в отличие от короткоживущих сигнал, излучаемый хемилюминесценции. Более того, программное обеспечение количественного Odyssey Imager обеспечивает большуючувствительность и линейность обнаружения по сравнению с традиционными количественного отсканированных рентгеновских пленок следующие хемилюминесценции. Однако, обнаружение пероксидазой хрена (HRP), конъюгированных антител с помощью хемилюминесценции может использоваться также.
Отсутствие классической лизосомальных деградации и обнаружения протеасомной деградации KISS1R описанных здесь, в НЕК-293 клетках наблюдались также в COS-7 клетки трансфицированных с тем же выражением MycKISS1R вектор 9. Хотя необычные, протеасомной деградации G-белком рецепторы уже сообщалось ранее в литературе 16,17.
Таким образом, эта рукопись свидетельствует о том, как изучение влияния генетических мутаций в гене KISS1R, который высоко GC-богатые последовательности, для того, чтобы понять, как мутации в этом рецепторов может привести к репродуктивной фенотипы расстройств, таких как гипогонадотропный гипогонадизма или преждевременное половое созревание .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа частично финансировалась Репродуктивное отделения Национального института детского здоровья и человеческого развития (NICHD - R21 HD059015) и Чарльз Х. Худа Фонд молодых следователь ребенка исследованиям в области здравоохранения премию (Бостон, Массачусетс).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PCRx Enhancer Solution | Invitrogen | 52391 | |
| PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase Alternative Detergent | Stratagene, Agilent Technologies | 600385 | |
| Dpn-I | New England Biolabs | R0176 | |
| XL10-Gold Ultracompetent E. coli cells | Stratagene, Agilent Technologies | 200314 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Geneporter Transfection Reagent | Genlantis | T201007 | |
| Leupeptin | Calbiochem | 108975 | |
| MG132 | Calbiochem | 47491 | |
| 10xPBS | Ambion | AM9625 | |
| Protease inhibitor cocktail and PMSF | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-24948 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 23225 | |
| anti-Myc tag (clone 4A6) agarose conjugate | EMD Millipore | 16-219 | |
| 2x loading buffer | Bio-Rad | 161-0737 | |
| Criterion Tris-HCl precast gel, 4-15% gradient | Bio-Rad | 345-0028 | |
| Immobilon-FL PVDF membrane | EMD Millipore | IPFL00010 | |
| Odyssey Blocking Buffer | LI-COR Biosciences | 927-40000 | |
| 10xTBS | Bio-Rad | 170-6435 | |
| Rabbit anti-myc antibody | Cell Signaling Technology | 2272 | |
| Goat anti-rabbit IRDye 800CW | LI-COR Biosciences | 926-32211 | |
| Odyssey Imaging Infrared System | LI-COR Biosciences | ||
| Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 78430 |
References
- Seminara, S. B., Messager, S., Chatzidaki, E. E. The GPR54 Gene as a Regulator of Puberty. N Engl J Med. 349, 1614-1627 (2003).
- de Roux, N., Genin, E., Carel, J. C. Hypogonadotropic Hypogonadism Due to Loss of Function of the KiSS1-Derived Peptide Receptor GPR54. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 10972-10976 (2003).
- Messager, S., Chatzidaki, E. E., Ma, D. Kisspeptin Directly Stimulates Gonadotropin-Releasing Hormone Release via G Protein-Coupled Receptor 54. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1761-1766 (2005).
- Teles, M. G., Bianco, S. D., Brito, V. N. A GPR54-Activating Mutation in a Patient with Central Precocious Puberty. N Engl J Med. 358, 709-715 (2008).
- Tenenbaum-Rakover, Y., Commenges-Ducos, M., Iovane, A. Neuroendocrine Phenotype Analysis in Five Patients with Isolated Hypogonadotropic Hypogonadism due to a L102P Inactivating Mutation of GPR54. J Clin Endocrinol Metab. 92, 1137-1144 (2007).
- Semple, R. K., Achermann, J. C., Ellery, J. Two Novel Missense Mutations in G Protein-Coupled Receptor 54 in a Patient with Hypogonadotropic Hypogonadism. J Clin Endocrinol Metab. 90, 1849-1855 (2005).
- Wacker, J. L., Feller, D. B., Tang, X. B. Disease-Causing Mutation in GPR54 Reveals the Importance of the Second Intracellular Loop for Class A G-Protein-Coupled Receptor Function. J Biol Chem. 283, 31068-31078 (2008).
- Szereszewski, J. M., Pampillo, M., Ahow, M. R. GPR54 regulates ERK1/2 activity and hypothalamic gene expression in a Galpha(q/11) and beta-arrestin-dependent manner. PLoS One. 5, e12964-e12964 (2010).
- Bianco, S. D. C., Vandepas, L., Correa-Medina, M., Gereben, B., Mukherjee, A., Kuohung, W., Carroll, R., Teles, M. G., Latronico, A. C., Kaiser, U. B. KISS1R Intracellular Trafficking and Degradation: Effect of the Arg386Pro Disease-Associated Mutation. Endocrinology. , Forthcoming (2011).
- Hutchison, C. A., Phillips, S., Edgell, M. H. Mutagenesis at a Specific Position in a DNA Sequence. J Biol Chem. 253, 6551-6560 (1978).
- Mullis, K. B. The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction. Sci Am. 262, 56-61 (1990).
- Henke, W., Herdel, K., Jung, K., Schnorr, D., Loening, S. A. Betaine improves the PCR amplification of GC-rich DNA sequences. Nucleic Acids Res. 25, 3957-3958 (1997).
- Sahdev, S., Saini, S., Tiwari, P., Saxena, S., Singh Saini, K. Amplification of GC-rich genes by following a combination strategy of primer design, enhancers and modified PCR cycle conditions. Mol Cell Probes. 21, 303-307 (2007).
- Kong, K. C. Chapter 10. MSTA. in G Protein-Coupled Receptors: Essential Methods. Poyner, D. R., Wheatly, M. , Wiley-Blackwell. 197-204 (2010).
- Hall, R. A. Chapter 9. G protein-Coupled Receptor-Protein Interactions. George, S. R., O'Dowd, B. F. , John Wiley & Sons, Inc. 170-171 (2005).
- Chaturvedi, K., Bandari, P., Chinen, N., Howells, R. D. Proteasome Involvement in Agonist-Induced Down-Regulation of Mu and Delta Opioid Receptors. J Biol Chem. 276, 12345-12355 (2001).
- Shenoy, S. K., McDonald, P. H., Kohout, T. A., Lefkowitz, R. J. Regulation of Receptor Fate by Ubiquitination of Activated Beta 2-Adrenergic Receptor and Beta-Arrestin. Science. 294, 1307-1313 (2001).
