Summary
ترتبط طفرات في مستقبلات kisspeptin (KISS1R) يعانون من اضطرابات الإنجابية في المرضى. نحن هنا تصف كيفية إدخال طفرات مهمة في تسلسل القيادة العامة الغنية KISS1R فضلا عن استخدام بنيات KISS1R لتوصيف مسار تدهور بواسطة مستقبلات مناعي وصمة عار الغربية.
Abstract
مستقبلات kisspeptin (KISS1R) هو مجموعة مستقبلات البروتين يقترن المعترف بها على الزناد من البلوغ ومنظم من الكفاءة التناسلية في مرحلة البلوغ 1،2،3. وقد ارتبطت طفرات في تعطيل KISS1R المحددة في المرضى الذين يعانون من ناقص موجهة الغدد التناسلية iodiopathic 1،2 (IHH) قصور الغدد التناسلية والبلوغ المبكر 4. الدراسات الفنية لهذه المسوخ حاسمة الأهمية بالنسبة لفهمنا للآليات الكامنة وراء تنظيم هذا الاستنساخ بواسطة مستقبلات فضلا عن تشكيل لنتائج المرض الذي ينجم عن إشارات KISS1R غير طبيعي وظيفة. ومع ذلك ، فإن تسلسل للغاية GC - الغنية من الجين KISS1R يجعل من الصعب أن أعرض بدلا الطفرات أو تضخيم هذا الجين الترميز بواسطة مستقبلات PCR.
نحن هنا تصف طريقة لإدخال طفرات من الفائدة في هذا التسلسل للغاية GC - الغنية التي استخدمت بنجاح لتوليد أكثر من المسوخ KISS1R عشرة في المختبر لدينا. ونحن الأمثل لتسهيل ظروف PCR التضخيم من مجموعة من المسوخ التي تشمل استبدال KISS1R ، والحذف أو الإدراج في التسلسل KISS1R. إضافة إلى حل محسن PCR ، فضلا عن نسبة مئوية صغيرة من DMSO كانت مفيدة بشكل خاص لتحسين التضخيم. قد يكون هذا الإجراء مفيدا الأمثل لقوالب GC - الغنية الأخرى كذلك.
واستخدمت ناقلات ترميز KISS1R التعبير لوصف الإشارات وظيفة هذا المستقبل من أجل أن نفهم كيف يمكن أن تغير KISS1R الطفرات وظيفة ، وتؤدي إلى الظواهر المرتبطة التناسلي. تبعا لذلك ، يمكن أن يتضح من التطبيقات المحتملة الناتجة عن المسوخ KISS1R الطفرات في الموقع من إخراج العديد من الدراسات 1،4،5،6،7،8. كمثال على ذلك ، وقد تبين الطفرة كسب من بين وظيفة في KISS1R (Arg386Pro) ، الذي يرتبط مع سن البلوغ المبكر ، إلى إطالة أمد استجابة لتحفيز مستقبلات يجند 4 وكذلك لتغيير معدل تدهور KISS1R 9 . ومن المثير للاهتمام ، والدراسات لدينا تشير إلى أن KISS1R هو المتدهورة التي proteasome ، في مقابل تدهور في الليزوزومية الكلاسيكية وصفها لمعظم مستقبلات البروتين يقترن G 9. في المثال المعروض هنا ، هو التحقيق تدهور KISS1R في خلايا الكلى البشرية الجنينية (كلوة الجنين البشري - 293) معربا عن عابر Myc الموسومة KISS1R (MycKISS1R) وتعامل مع مثبطات proteasome أو يحلول. وimmunoprecipitated lysates الخلية باستخدام agarose - مترافق المضادة للأجسام المضادة myc يليه تحليل لطخة غربية. يتم إجراء الكشف النوعي والكمي لMycKISS1R على البقع باستخدام نظام أوديسي LI - COR الأشعة تحت الحمراء. قد يكون هذا النهج مفيدا في دراسة تدهور البروتينات الأخرى ذات الاهتمام كذلك.
Protocol
1. موقع الطفرات الموجهة للغاية GC - الغنية تسلسل الجينات KISS1R
- قالب : [كدنا] تسلسل الكامل للKISS1R الإنسان مع العلامة - Myc تنصهر في النهاية - N والخمسين. هو استنساخ هذا التسلسل في التعبير pCS2 ناقلات + ، وهو متوافق مع خطوط خلايا الثدييات لاستخدامها لاحقا transfections. ويشار إلى هذا التعبير الموجه إليها هنا باسم Myc pCS2 KISS1R +.
- التصميم التمهيدي : مصممة لحمل الاشعال الطفرات المطلوبة ، وفقا لتعليمات من عدة Quikchange الطفرات الموقع الموجه (Stratagene). في الخلاصة :
- يجب على كلا الاشعال (إلى الأمام وعكس) تحتوي على الطفرة المرجوة ويصلب لتسلسل نفسه على العكس من فروع البلازميد (إلى الأمام وعلى سبيل المثال الاشعال عكس مكملة لبعضها البعض)
- وينبغي أن يكون الاشعال 25-45 قواعد طويلة وتنتهي في واحد أو أكثر أو قواعد C G
- وينبغي أن تحور قدم (ق) تكون في منتصف التمهيدي ويحيط به من قواعد 10-15 ~ التسلسل الصحيح في كلا الجانبين
- وينبغي أن درجة حرارة انصهار (TM) من الاشعال تكون مساوية أو أكبر من 78 درجة مئوية. استخدام الصيغ التالية لتقدير تيم :
- عند إدخال طفرات : TM = 81.5 + 0.41 (٪ GC) -- 675 / N -- عدم تطابق ٪ (N هو طول التمهيدي في القواعد)
- عند إدخال الإدراج أو الحذف : TM = 81.5 + 0.41 (٪ GC) -- 675 / N (N لا تتضمن القواعد التي يجري إدراجها أو حذفها)
- استخدام أجهزة الاشعال المحلاة (لا التنقيات ضرورية أخرى).
- يجب على كلا الاشعال (إلى الأمام وعكس) تحتوي على الطفرة المرجوة ويصلب لتسلسل نفسه على العكس من فروع البلازميد (إلى الأمام وعلى سبيل المثال الاشعال عكس مكملة لبعضها البعض)
- أفضل الظروف التضخيم تشمل إضافة PCRx محسن الحل (Invitrogen) وDMSO. وينبغي اختبار لا يقل عن 2 تركيزات DMSO ، مثل 4 ٪ و 8 ٪. وترد شروط الاسترداد الواردة في الجدول الأول وفي الشكل 1 ؛ ويظهر نتائج PCR التضخيم ممثل pCS2 + MycKISS1R في الشكل 2.
- القضاء على الحمض النووي الأبوية على منتجات التضخيم من قبل هضم الحمض النووي ميثليته مع DpnI عن 1H 30min عند 37 درجة مئوية : المزيج في جهاز للطرد المركزي 17.5μl أنبوب من الناتج PCR مع 2μl من NEBuffer 10X 4 و 0.5μl من DpnI (10U ؛ Biolabs نيو إنجلاند).
- تحويل المعاملة DpnI PCR المنتج : مزيج من 2μl DpnI المعالجة مع الحمض النووي لل45μl XL10 الذهب E. Ultracompetent القولونية (Stratagene) في مرحلة ما قبل مبردة أنبوب 15 مل ثقافة الخلية. إضافة 2μl من المركابتويثانول - β واتبع تعليمات Stratagene. 100 لوحة من البكتيريا 400μl تحول في LB - آغار لوحات تحتوي على 100μg/ml أمبيسلين واحتضان عند 37 درجة مئوية.
- Miniprep 2-4 المستعمرات الفردية لعزل الحمض النووي البلازميد. تأكيد تطبيق ناجح من الطفرات المطلوبة من قبل تسلسل وتحليل الحمض النووي معزولة.
2. عابر ترنسفكأيشن من MycKISS1R كلوة الجنين البشري في خلايا - 293
- وتجرى التجارب التالية في خلايا الكلى البشرية الجنينية (كلوة الجنين البشري - 293) مثقف في حاضنة CO 2 (5 ٪ CO 2) في 37 درجة مئوية في DMEM تستكمل مع مصل بقري جنيني من 10 ٪ (FBS) و 1 ٪ البنسلين / الستربتوميسين.
- كلوة الجنين البشري البذور - 293 الخلايا في الخلايا 2.5x10 5 / مل في 6 لوحات وكذلك السماح لهم تنمو بين عشية وضحاها على 37 درجة مئوية قبل ترنسفكأيشن. ملاحظة : (ط) استخدام الآبار ثلاث نسخ لكل حالة تجريبية ، (الثاني) التقاء مثالية الخلية في وقت ترنسفكأيشن هو 30 ٪ -50 ٪.
- كلوة الجنين البشري Transfect - 293 الخلايا باستخدام الكاشف ترنسفكأيشن GenePorter (Genlantis) ، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة : نصف مزيج من DMEM المصل الحرة مع 0.5μg pCS2 + MycKISS1R 0.5μg زائد التحكم (فارغة) متجه إلى جمل 1μg من الحمض النووي / أيضا. مزيج والنصف الآخر مع كاشف ترنسفكأيشن 10μl ميكروغرام من الحمض النووي لكل transfected. ملاحظة : المثالي تركيز الحمض النووي البلازميد قد تختلف.
3. علاج الخلايا وتحلل
- 24H بعد ترنسفكأيشن ، استبدل المتوسطة مع الخلايا التي تحتوي على 1ml DMEM FBS 2.5 ٪ (لانخفاض استقلاب الخلية). ملاحظة : هذا الانخفاض في المصل قد تسهل و / أو تضخيم الكشف عن النتائج.
- إضافة مثبط يحلول (100μg / بئر Leupeptin) مباشرة في كل بئر واحد لوحة 6 - جيدا بأكملها. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 6 أو 16 ساعة (أو غيرها من الأوقات المطلوبة)
- إضافة مثبط proteasome أعدت حديثا (10μM / بئر MG132) مباشرة في جميع آبار صفيحتين 6 - جيدا بأكملها. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ، 6 ، 4 أو 16H (أو أوقات المطلوب). إضافة السيارة إلى جميع الآبار من لوحة 6 - جيدا الرابع (0 الوقت نقطة) واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 16H
- عندما انتهت الحضانة ، نقل صفائح الجليد لتنفيذ هذا الإجراء ، وتحلل كامل على الجليد لمنع تدهور البروتين :
- لزيادة الغلة من البروتين ، والجمع بين triplicates في 6 - جيدا في لوحات واحد سنترifuge أنبوب
- نضح المتوسطة ويغسل مرة واحدة مع الخلايا 1ml من الفوسفات الجليد الباردة مخزنة المالحة (PBS)
- إضافة 100μl من الجليد الباردة العازلة تحلل (HEPES 20mM ، ودرجة الحموضة 7.4 ، 1 ٪ NP - 40 ، 150mM كلوريد الصوديوم ، 1MM EDTA ، 0.25 ٪ deoxycholate الصوديوم) التي تحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني (1X الكوكتيل التي تحتوي على حمض الهيدروكلوريك ، 100mM AEBSF ، 80μM أبروتينين ، bestatin 5mm ، و 1.5mM E - 64 ، 0.5M EDTA ، leupeptin 2mm وو1MM A pepstatin ، بالإضافة إلى PMSF 2mm و) إلى كل جانب
- إزالة الخلايا مع مكشطة الخلية والخلية لنقل lysates أنابيب الطرد المركزي
- تمر خلايا ~ 10 مرات من خلال إبرة عيار 20. ملاحظة : لا يقصد يصوتن عينات للكشف عن وصمة عار الغربي من بروتينات الغشاء. صوتنة يؤدي الى تكدس بروتينات الغشاء ، والتي سوف لا ترحيل بشكل صحيح أثناء الكهربائي
- احتضان lysates الخلية ل1H عند درجة 4 على منصة هزاز
- lysates الخلية الطرد المركزي في 4 درجات مئوية لمدة 10 دقيقة في الدقيقة العاشرة و10000 supernatants لأنابيب نقل جديدة. ملاحظة : لا تخل هذه الخطوة خلال الكريات
- تحديد تركيز البروتين في 10μl من supernatants باستخدام الأسلوب BCA (بيرس)
- لتمييع lysates 1mg/ml العازلة مع تحلل تحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني.
4. كشف مناعي والغربية لطخة من MycKISS1R
- نفذ الخطوات التالية مناعي على الجليد (أو على 4 درجات مئوية) :
- تغسل كمية مناسبة من الأجسام المضادة لمكافحة myc agarose - مترافق (2.5μg / العينة) مرتين مع الثلج الباردة PBS وإضافة إلى هذا 400μg lysate من البروتين.
- Immunoprecipitate في MycKISS1R على lysates بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في منصة هزاز مع الانفعالات لطيف.
- تدور باستمرار الخرز agarose بواسطة الطرد المركزي نبضة في 4 درجات مئوية (تصل إلى 10000 دورة في الدقيقة العاشرة)
- نضح وتجاهل supernatants (من دون إزعاج الكريات)
- تغسل حبات مرة واحدة مع الثلج الباردة العازلة تحلل ومرتين مع الثلج الباردة برنامج تلفزيوني. عكس أنابيب بلطف قبل الغزل
- الخرز Ressuspend تحتوي على أجسام مضادة محددة MycKISS1R في 2X العازلة تحميل عينة تحتوي على 10 ٪ β - المركابتويثانول.
- وصمة عار للغرب immunocomplexes MycKISS1R :
- عينات الحرارة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. ملاحظة : لا تغلي عينات للكشف عن المقصود لطخة الغربي من البروتينات الغشاء. مثل صوتنة ، الغليان يؤدي أيضا إلى تجميع هذه البروتينات
- أنابيب نقل على الفور الى الثلج لمدة 5 دقائق
- فصل البروتينات بواسطة SDS - PAGE في جل الانحدار 4-15 ٪.
- نقل إلى غشاء PVDF Immobilon - FL (الأشعة تحت الحمراء للكشف) في 25V لمدة 30 دقيقة في نقل العازلة (48mM قاعدة تريس ، 39mM جليكاين ، 1.2mM SDS ، والميثانول بنسبة 20 ٪ ، ودرجة الحموضة 9.2) باستخدام بيو راد شبه الجافة نقل جهاز
- غسل الأغشية لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع تريس مخزنة المالحة (TBS) ، وكتلة ل1H في درجة حرارة الغرفة مع شركة اوديسي Licor حظر على منصة هزاز (بدلا من ذلك ، يمكن استخدام الحليب 5 ٪ في TBS إلى كتلة غير محددة وملزمة).
- احتضان الأغشية بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع الأضداد المضادة للmyc الأرانب (1:500) في محلول يحتوي على 0.1 ٪ حجب توين - 20
- إزالة الأجسام المضادة الأولية وغسل الأغشية 3 مرات في 5 دقائق مع كل TBS تحتوي على 0.1 ٪ توين - 20 (TBST)
- الأغشية لاحتضان 1H في درجة حرارة الغرفة مع مفتش الماعز المضادة للأرنب الأشعة تحت RedDye ® - 800CW المسمى (1:10،000) في عرقلة العازلة التي تحتوي على 0.1 ٪ توين - 20 و 0.01 ٪ SDS
- إزالة الأجسام المضادة الثانوية ، وغسل الأغشية 3 مرات في 5 دقائق مع كل TBST ولمرة واحدة فقط مشاركة مع TBS (لإزالة ما تبقى توين - 20)
- التصوير والكمي للMycKISS1R باستخدام LI - COR أوديسي تصوير بالأشعة دون الحمراء :
- وسيتم تصويره في MycKISS1R على الأغشية باستخدام LI - COR أوديسي تصوير بالأشعة دون الحمراء. لتبدأ ، ومكان غشاء على الزاوية اليسرى السفلية من الماسح أوديسي ، تماشيه مع الشبكة. تغطية مع حصيرة من المطاط ، على نحو سلس من فقاعات مع الأسطوانة وإغلاق الغطاء
- إنشاء ملف مشروع جديد على الكمبيوتر. اسم الملف ، انقر على "فعل" ، ومن ثم أدخل على الدخول الماسح الضوئي "مسح". حجم وحدة الماسحة الضوئية مربع لاحتواء الغشاء ، ومن ثم اختيار القرار 169μm والمتوسطة جودة الصورة
- اختيار إعدادات الكثافة ل700 (أحمر) و 800 (أخضر) قنوات وفقا لقوة كل من يتوقع إشارة. هذا هو التصور لأغراض الإشارة فقط ولن تؤثر على القياس الكمي. انقر على "بدء الفحص"
- اسم وحفظ المسح الضوئي ، ثم انقر فوق "موافق" لفتحه في نافذة جديدة للالكمي. وينبغي أن تكون مرئية مونومرات MycKISS1R في حوالي 43kD
- باستخدام الأداة "مربع" (على الشريط الجانبي الأيمن) ، رسم مربع حول الفرقة الأولى. اسحب مربع حول للتأكد من تناسب في جميع نطاقات ، ثم "نسخ" و "لصق" مربع على جميع نطاقات
- حدد كافة المربعات باستخدام "على Ctrl + A" ، ثم حدد الخيار لطرح الخلفية المتوسط. انقر على زر "تقرير" في القائمة العليا وجدول مع القيم الكمي سيظهر. النتائج المعروضة هنا هي ممثل represented فضلا عن أكثر من الخلايا غير المعالجة أضعاف - (الوقت صفر)
5. ممثل النتائج :
- موقع الطفرات الموجهة للغاية GC - الغنية KISS1R التسلسل الجيني :
الجدول 1. يظهر مجموعة من الكواشف لتحسين كفاءة KISS1R التضخيم. وكان هذا الجمع استخدمت بنجاح لإدخال العديد من الطفرات الموجهة ضد مناطق مختلفة من تسلسل KISS1R [كدنا] ، فضلا عن التضخيم من هذا الجين للغاية GC - الغنية. الشكل 1 يبين ركوب الدراجات والتضخيم الظروف لمن الطفرات KISS1R. تم تعديل هذه الشروط من عدة QuikChange الطفرات الموقع الموجه (Stratagene).
الشكل 2. يظهر نتيجة لاستخدام هذا البروتوكول ممثل الأمثل. إضافة 4 ٪ أو 8 ٪ DMSO جنبا إلى جنب مع محسن PCRx تحسن كبير في العائد من التضخيم من البلازميد KISS1R [كدنا] المحتوية GC - الغنية. في هذه التجربة التمثيلية ، شريطة DMSO 4 ٪ التضخيم ظروف أفضل قليلا مقارنة DMSO 8 ٪. التحول من المنتجات التضخيم DpnI المعاملة مع E. ultracompetent غلة القولونية عادة من 100 إلى أكثر من 1،000 المستعمرات ، ونسبة النجاح في إدخال طفرات المطلوب هو 80-90 ٪ وفقا لما يحدده تسلسل الحمض النووي. - استخدام البنى MycKISS1R لدراسة علم وظائف الأعضاء مستقبلات :
في هذه التجربة التمثيلية ، النوع البري pCS2 + MycKISS1R تضخيم وفقا لبروتوكول الأمثل هو موضح هنا كانوا يدرسون في تدهور مستقبلات الجسم الحي KISS1 في خط الخلية ذات الصلة (كلوة الجنين البشري - 293) معربا عن MycKISS1R عابر. بعد علاج transfected كلوة الجنين البشري - 293 مع مثبطات خلايا (MG132) يحلول (leupeptin) أو proteasome وفقا للبروتوكول وصفها في الأساليب ، وlysed الخلايا ومعالجتها لطخة غربية. لوحة العلوي من الشكل 3 يبين فحص مونومرات MycKISS1R حين يظهر أسفل لوحة من القياس الكمي للعصابات التي تظهر على اللوحة العلوية. الكمي لأنه لا يشير إلى العصابات ولا 6H 16H العلاج leupeptin المتضررة مستويات البروتين MycKISS1R. على العكس من ذلك أدت المعاملة مع MG132 في الوقت التي تعتمد على زيادة البروتين في MycKISS1R في هذه الخلايا ، والذي يتوج مع تراكم 45 ضعفا من مستقبلات بعد 16H من الحضانة مع MG132. هذه الملاحظات تشير إلى أنه ، خلافا لمعظم مستقبلات البروتين يقترن G ، KISS1R هو المتدهورة التي proteasome (بدلا من يحلول).
| DMSO | |||
| الكواشف | 0 | 4 ٪ | 8 ٪ |
| ماء | 35 | 33 | 31 |
| 10X Pfu الترا طق العازلة | 5 | 5 | 5 |
| dNTP مزيج (10MM) | 1 | 1 | 1 |
| بمعنى التمهيدي (25pmol/μl) | 1 | 1 | 1 |
| العقاقير التمهيدي (25pmol/μl) | 1 | 1 | 1 |
| 10X الحل PCRx محسن | 5 | 5 | 5 |
| DMSO | 0 | 2 | 4 |
| Pfu بوليميريز طق الترا (2.5U/μl) | 1 | 1 | 1 |
| بلازميد الحمض النووي (20ng/μl) | 1 | 1 | 1 |
الجدول 1. مزيج من الكواشف المستخدمة بنجاح لتتحول وتضخيم KISS1R GC - الغنية
الشكل 1. شروط تدوير الطفرات ناجحة والتضخيم من GC - الغنية KISS1R : تم اتباع بدء 2min الساخنة بنسبة 18 دورات من ذوبان ثانية 30 الى 95 درجة مئوية ، 1 دقيقة الصلب عند درجة حرارة 55 مئوية ودقيقة التمديد 6 إلى 68 درجة مئوية. تمديد إضافي 10 دقيقة في 68 درجة مئوية وأضيف في نهاية الدورة الماضية. تم تعديل هذه الإعدادات من البروتوكول الطفرات الأصلي للمجموعة الثانية QuikChange الطفرات XL - الموقع الموجه (Stratagene).
الشكل 2. تصور GC - الغنية pCS2 + Myc KISS1R تضخيمه في وجود أو عدم وجود DMSO : KISS1R Myc خمسة aliquots ميكرولتر من pCS2 + تضخيم في حضور 0 ، 4 أو 8 ٪ وكانت محملة DMSO في هذا الجل ممثل agarose 1 ٪ ملطخة إيثيديوم الميثيل وتصور باستخدام الأشعة فوق البنفسجية. عصابات البلازميد من 6Kb مرئية على حد سواء الممرات محملة بالمنتجات PCR تضخيمها في وجود 4 ٪ و 8 ٪ DMSO ، ولكن ليس على المسار الأول ، الذي تم تحميله مع PCRالمنتج تتضخم في غياب DMSO.
الشكل 3. وعولج كلوة الجنين البشري - 293 معربا عن الخلايا Myc KISS1R مع leupeptin 100μg/ml أو 10μM MG132 عند 37 درجة مئوية في أوقات معينة : أثر leupeptin أو MG132 على مستويات البروتين في الخلايا KISS1R Myc - 293 كلوة الجنين البشري. وكان immunoprecipitated Myc KISS1R على 400μg lysate من الخلية مع 2.5μg من الأجسام المضادة لمكافحة myc agarose - مترافق وتحليلها بواسطة لطخة غربية. (أ) كشف أوديسي LI - COR من KISS1R Myc بعد حضانة immunoblots مع الأضداد المضادة لل- Myc علامة الأرنب تليها الحضانة مع IRDye 800CW ذات العلامات المضادة للأرنب ، (B) الكمي لعصابات KISS1R Myc هو موضح في (A) باستخدام LI - COR برنامج أوديسي الكمي. وتتمثل النتائج فضلا عن أكثر من الخلايا غير المعالجة (الوقت 0) أضعاف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد استخدمت موقع الطفرات الموجهة لدراسة وظيفة البروتين من خلال إدخال تغييرات في تسلسل النوكليوتيدات ترميز الجينات المستهدفة على مدى ثلاثة عقود. وقد وصفت هذه التقنية الأصلي في عام 1978 من قبل الصيدلي البريطاني والكندي الحائز على جائزة نوبل مايكل سميث 10. المشتركة مايكل سميث عام 1993 جائزة نوبل في الكيمياء مع كاري موليس ، والكيمياء الحيوية الأمريكي الذي اخترع تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) 11. تم تحسين الأسلوب الأصلي التي وصفها مايكل سميث على مر السنين. وقد ساهم القدرة على إدخال طفرات ، الإدراج أو الحذف في تسلسل الجينات المرغوب في تفاعل PCR واحدة لدقة عالية ومعدلات نجاح هذا الإجراء ، وكذلك لإنتاج طفرات في فترة قصيرة نسبيا من الزمن.
على الرغم من كل التحولات التقنية والتحسينات والتضخيم للتسلسل الجيني للغاية GC - الغنية مثل KISS1R هي مزعجة للغاية. ولا بد من تعديل حجم الاشعال مصممة لالطفرات عالية المحتوى GC متواليات لاستيعاب محتوى GC بحيث درجة حرارة انصهار ضمن النطاق الموصى به. تبعا لذلك ، الاشعال لإدخال طفرات في KISS1R والحجم ليكون نقطة انصهار بين 78 درجة -86 درجة مئوية. بعض المناطق لديها جينات KISS1R GC المحتوى أكثر من 85 ٪. ولا بد من تعديل حجم الاشعال صممت لإدخال طفرات في هذه المناطق لتلبية مجموعة نقطة انصهار المذكورة أعلاه. قد الاشعال مع النقاط المذكورة أعلاه التي تحد من ذوبان يست منفصلة في 95 درجة مئوية ، وإضعاف التضخيم. من ناحية أخرى ، الاشعال مع تيم أقل من 78 درجة مئوية هي أكثر عرضة للربط وتضخيم غير محددة متواليات.
وبالمثل ، يتم تحسين ظروف التضخيم والكواشف لتسلسل محتوى عالي من KISS1R GC. ويرد مزيج من DMSO 4 ٪ ومحلول PCR محسن من Invitrogen (الجدول 1 والشكل 2) لزيادة الكفاءة التضخيم من KISS1R. بدلا من ذلك ، تم الكواشف الأخرى مثل البيتين استخدمت بنجاح لتحسين التضخيم من تسلسل القيادة العامة الأخرى الغنية 12،13. ومع ذلك ، لم يكن هناك أي تأثير ملحوظ على البيتين الإيجابية لتضخيم KISS1R في أيدينا. أيضا ، قد PCR حلول محسن المتاحة من الموردين الآخرين تكون قادرة على قدم المساواة لتحسين التضخيم من متواليات GC الغنية.
باستخدام الإعدادات الأمثل الموصوفة هنا ، أدخلنا بنجاح العديد من الطفرات في مناطق مختلفة من KISS1R [كدنا] ، والتي شملت حتى 6 تغييرات النوكليوتيدات مرة واحدة (التي يحملها الاشعال نفسه) وحذف ما يصل إلى 27 النيوكليوتيدات ، ولدت هذه المسوخ تحول مئات الآلاف من المستعمرات بنسبة (80-90 ٪) مرتفعة من المستعمرات التي تحتوي على التسلسل الصحيح متحولة أكده تسلسل الحمض النووي.
ويمكن أيضا توجيه الطفرات موقع يمكن استخدامها لإضافة علامات مستضدي مثل Myc أو العلم إلى محطة الأمينية أو الكربوكسيل من البروتينات. هذه العلامات تسمح لمناعي انتقائية و / أو الكشف عن البروتينات ، ومفيدة خصوصا عندما موثوق بها ضد الأجسام المضادة للبروتين في المصالح ليست متوفرة ، أما بالنسبة KISS1R. في المثال المعروضة هنا ، يتم استخدام ترميز التعبير الموجه للKISS1R التي تنصهر فيها لأحد عشر بصمة الحمض الأميني - Myc في النهاية الأمينية والخمسين (cKISS1R بلدي) ، لدراسة مسار تدهور في الخلايا KISS1R - 293 كلوة الجنين البشري. كفاءة الخلايا ترنسفكأيشن - 293 كلوة الجنين البشري مع cKISS1R بلدي باستخدام الطريقة الموصوفة هنا هو 25-30 ٪. وهكذا ، يتم استخدام مناعي للتركيز cKISS1R بي من lysates الخلية وبالتالي تحسين الكشف والتصور للمستقبل. وكثيرا ما يستخدم هذا النهج لتسهيل تصور التطور الطبيعي للبروتينات وأعرب عند مستويات منخفضة وكذلك 14.
الأهم ، لا ينبغي أن يقترن G - مستقبلات البروتين مثل KISS1R ، فضلا عن بروتينات غشاء الأخرى ، التي تكون متجانسة أو صوتنة المغلي قبل تحميل هلام. بينما تستخدم عادة هذه الإجراءات لمعالجة عينات للمناعي أو لطخة غربية ، وتؤدي صوتنة المغلي لتجميع البروتينات الغشاء ، عرقلة الهجرة بشكل سليم خلال الكهربائي 15. في الواقع ، واستبدال هذه الإجراءات مع تجانس أكثر اعتدالا ، مثل ممر إبرة ، وخفض التدفئة العينة ، مثل 37 درجة مئوية هو مطلوب لمدة 30 دقيقة (وليس المغلي) للكشف عن مونومرات KISS1R.
Immunoprecipitated يتم الكشف cKISS1R بلدي باستخدام تصوير أوديسي (LI - COR النظم البيولوجية) بعد حضانة البقع مع الضد صبغ مترافق الأشعة تحت الحمراء الثانوية. مزايا هذا النظام تتضمن إشارة قوية على أن الحفاظ على ويمكن الكشف بدقة عالية لعدة أشهر ، في مقابل إشارة قصيرة الأجل المنبعثة من معان كيميائي. وعلاوة على ذلك ، فإن البرنامج الكمي للتصوير أوديسي تقدم أكبرحساسية والخطي للكشف بالمقارنة مع الكمي التقليدي للأفلام الأشعة السينية الممسوحة التالية لمعان كيميائي. ومع ذلك ، قد يتم استخدام الكشف عن بيروكسيداز الفجل (HRP) ، مترافق الأجسام المضادة التي كتبها لمعان كيميائي كذلك.
غياب تدهور الليزوزومية الكلاسيكية والكشف عن تدهور proteasomal من KISS1R الموصوفة هنا في خلايا - 293 كلوة الجنين البشري كما لوحظ في COS - 7 خلايا transfected مع نفس التعبير MycKISS1R ناقلات 9. وإن كان قد غير عادي ، وتدهور proteasomal مستقبلات البروتين يقترن G ذكرت سابقا في الأدب 16،17.
باختصار ، هذه المخطوطة يوضح كيفية تحقيق تأثير الطفرات الجينية في جين KISS1R ، وهو تسلسل للغاية GC - الغنية ، من أجل فهم كيفية حدوث طفرات في هذا المستقبل يمكن أن يؤدي إلى اضطراب الظواهر الإنجابية مثل مستويات افراز هرمونات المناسل أو سن البلوغ المبكر .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل جزئيا من قبل فرع الإنجابية من المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية (معاهد الصحة القومية -- R21 HD059015) والتي H. تشارلز هود الطفل مؤسسة جائزة الباحث الشاب بحوث الصحية (بوسطن ، ماساتشوستس).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PCRx Enhancer Solution | Invitrogen | 52391 | |
| PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase Alternative Detergent | Stratagene, Agilent Technologies | 600385 | |
| Dpn-I | New England Biolabs | R0176 | |
| XL10-Gold Ultracompetent E. coli cells | Stratagene, Agilent Technologies | 200314 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Geneporter Transfection Reagent | Genlantis | T201007 | |
| Leupeptin | Calbiochem | 108975 | |
| MG132 | Calbiochem | 47491 | |
| 10xPBS | Ambion | AM9625 | |
| Protease inhibitor cocktail and PMSF | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-24948 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 23225 | |
| anti-Myc tag (clone 4A6) agarose conjugate | EMD Millipore | 16-219 | |
| 2x loading buffer | Bio-Rad | 161-0737 | |
| Criterion Tris-HCl precast gel, 4-15% gradient | Bio-Rad | 345-0028 | |
| Immobilon-FL PVDF membrane | EMD Millipore | IPFL00010 | |
| Odyssey Blocking Buffer | LI-COR Biosciences | 927-40000 | |
| 10xTBS | Bio-Rad | 170-6435 | |
| Rabbit anti-myc antibody | Cell Signaling Technology | 2272 | |
| Goat anti-rabbit IRDye 800CW | LI-COR Biosciences | 926-32211 | |
| Odyssey Imaging Infrared System | LI-COR Biosciences | ||
| Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 78430 |
References
- Seminara, S. B., Messager, S., Chatzidaki, E. E. The GPR54 Gene as a Regulator of Puberty. N Engl J Med. 349, 1614-1627 (2003).
- de Roux, N., Genin, E., Carel, J. C. Hypogonadotropic Hypogonadism Due to Loss of Function of the KiSS1-Derived Peptide Receptor GPR54. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 10972-10976 (2003).
- Messager, S., Chatzidaki, E. E., Ma, D. Kisspeptin Directly Stimulates Gonadotropin-Releasing Hormone Release via G Protein-Coupled Receptor 54. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1761-1766 (2005).
- Teles, M. G., Bianco, S. D., Brito, V. N. A GPR54-Activating Mutation in a Patient with Central Precocious Puberty. N Engl J Med. 358, 709-715 (2008).
- Tenenbaum-Rakover, Y., Commenges-Ducos, M., Iovane, A. Neuroendocrine Phenotype Analysis in Five Patients with Isolated Hypogonadotropic Hypogonadism due to a L102P Inactivating Mutation of GPR54. J Clin Endocrinol Metab. 92, 1137-1144 (2007).
- Semple, R. K., Achermann, J. C., Ellery, J. Two Novel Missense Mutations in G Protein-Coupled Receptor 54 in a Patient with Hypogonadotropic Hypogonadism. J Clin Endocrinol Metab. 90, 1849-1855 (2005).
- Wacker, J. L., Feller, D. B., Tang, X. B. Disease-Causing Mutation in GPR54 Reveals the Importance of the Second Intracellular Loop for Class A G-Protein-Coupled Receptor Function. J Biol Chem. 283, 31068-31078 (2008).
- Szereszewski, J. M., Pampillo, M., Ahow, M. R. GPR54 regulates ERK1/2 activity and hypothalamic gene expression in a Galpha(q/11) and beta-arrestin-dependent manner. PLoS One. 5, e12964-e12964 (2010).
- Bianco, S. D. C., Vandepas, L., Correa-Medina, M., Gereben, B., Mukherjee, A., Kuohung, W., Carroll, R., Teles, M. G., Latronico, A. C., Kaiser, U. B. KISS1R Intracellular Trafficking and Degradation: Effect of the Arg386Pro Disease-Associated Mutation. Endocrinology. , Forthcoming (2011).
- Hutchison, C. A., Phillips, S., Edgell, M. H. Mutagenesis at a Specific Position in a DNA Sequence. J Biol Chem. 253, 6551-6560 (1978).
- Mullis, K. B. The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction. Sci Am. 262, 56-61 (1990).
- Henke, W., Herdel, K., Jung, K., Schnorr, D., Loening, S. A. Betaine improves the PCR amplification of GC-rich DNA sequences. Nucleic Acids Res. 25, 3957-3958 (1997).
- Sahdev, S., Saini, S., Tiwari, P., Saxena, S., Singh Saini, K. Amplification of GC-rich genes by following a combination strategy of primer design, enhancers and modified PCR cycle conditions. Mol Cell Probes. 21, 303-307 (2007).
- Kong, K. C. Chapter 10. MSTA. in G Protein-Coupled Receptors: Essential Methods. Poyner, D. R., Wheatly, M. , Wiley-Blackwell. 197-204 (2010).
- Hall, R. A. Chapter 9. G protein-Coupled Receptor-Protein Interactions. George, S. R., O'Dowd, B. F. , John Wiley & Sons, Inc. 170-171 (2005).
- Chaturvedi, K., Bandari, P., Chinen, N., Howells, R. D. Proteasome Involvement in Agonist-Induced Down-Regulation of Mu and Delta Opioid Receptors. J Biol Chem. 276, 12345-12355 (2001).
- Shenoy, S. K., McDonald, P. H., Kohout, T. A., Lefkowitz, R. J. Regulation of Receptor Fate by Ubiquitination of Activated Beta 2-Adrenergic Receptor and Beta-Arrestin. Science. 294, 1307-1313 (2001).
