Mutagenesi e analisi delle mutazioni genetiche in GC-ricchi Sequenza Receptor KISS1 identificati nell'uomo con disturbi dell'apparato riproduttivo
Summary
Le mutazioni nel recettore kisspeptina (KISS1R) sono associati a disordini riproduttivi nei pazienti. Qui si descrive come introdurre mutazioni di interesse per il GC-ricca sequenza di KISS1R così come l'uso di costrutti KISS1R per caratterizzare il percorso di degradazione del recettore di immunoprecipitazione e western blot
Abstract
Il recettore kisspeptina (KISS1R) è una proteina G-recettore accoppiato riconosciuto come il grilletto della pubertà e un regolatore di competenza riproduttiva in età adulta 1,2,3. Mutazioni inattivanti in KISS1R identificate nei pazienti sono stati associati con iodiopathic ipogonadismo ipogonadotropo (IHH) 1,2 e la pubertà precoce 4. Studi funzionali di questi mutanti sono cruciali per la nostra comprensione dei meccanismi alla base della regolazione della riproduzione di questo recettore così come quelli plasmare gli esiti della malattia, che derivano da segnalazione KISS1R anormale e funzione. Tuttavia, la sequenza altamente GC-ricchi del gene KISS1R rende piuttosto difficile introdurre mutazioni o amplificare il gene che codifica per il recettore mediante PCR.
Qui si descrive un metodo per introdurre mutazioni di interesse in questa sequenza altamente GC-ricco che è stato usato con successo per generare più di un dozzina di mutanti KISS1R nel nostro laboratorio. Abbiamo ottimizzato le condizioni di PCR per facilitare l'amplificazione di una serie di mutanti KISS1R che includono sostituzioni, cancellazioni o inserimenti nella sequenza KISS1R. L'aggiunta di una soluzione di PCR enhancer, oltre che di una piccola percentuale di DMSO sono stati particolarmente utili per migliorare l'amplificazione. Questa procedura ottimizzata può essere utile per altri modelli GC ricchi pure.
Il vettore di espressione che codifica per il KISS1R è stato utilizzato per caratterizzare la segnalazione e la funzione di questo recettore al fine di comprendere come le mutazioni possono cambiare KISS1R funzione e portano alla fenotipi associati riproduttivo. Di conseguenza, le potenziali applicazioni di mutanti KISS1R generato dalla mutagenesi sito-specifica può essere illustrato da molti studi 1,4,5,6,7,8. A titolo di esempio, il guadagno di funzione mutazione nel KISS1R (Arg386Pro), che è associato con pubertà precoce, ha dimostrato di prolungare la risposta del recettore per la stimolazione ligando 4, nonché di modificare la velocità di degradazione di KISS1R 9 . È interessante notare che i nostri studi indicano che KISS1R è degradato dal proteasoma, in contrapposizione al degrado classico lisosomiale descritto per la maggior parte G recettori accoppiati alla proteina 9. Nell'esempio qui presentato, il degrado del KISS1R è studiato in cellule renali embrionali umane (HEK-293) transitoriamente esprimere Myc-tag KISS1R (MycKISS1R) e trattati con inibitori del proteosoma o lisosomi. Lisati cellulari sono immunoprecipitati utilizzando un agarosio coniugata con anticorpi anti-myc seguita da analisi Western Blot. Individuare e quantificare le MycKISS1R su macchine viene eseguita utilizzando il LI-COR sistema a infrarossi Odyssey. Questo approccio può essere utile nello studio della degradazione di altre proteine di interesse pure.
Protocol
Discussion
Mutagenesi sito-diretta è stata utilizzata per studiare la funzione delle proteine con l'introduzione di cambiamenti nucleotide nella sequenza codificante del gene targeting per oltre tre decenni. La tecnica originale è stata descritta nel 1978 dal chimico britannico-canadese e Premio Nobel Michael Smith 10. Michael Smith condiviso il Premio Nobel 1993 per la chimica Kary Mullis, con il biochimico americano che ha inventato la reazione a catena della polimerasi (PCR) 11. Il metodo origi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato parzialmente finanziato dalla Filiale di riproduzione del National Institute of Child Health e lo Sviluppo Umano (NICHD – R21 HD059015) e dalla Charles H. Hood Fondazione Premio Giovani Bambino Investigator Research Salute (Boston, MA).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| 10x PCRx Enhancer Solution | Invitrogen | 52391 |
| PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase Alternative Detergent | Stratagene | 600385 |
| Dpn-I | New England Biolabs | R0176 |
| XL10-Gold Ultracompetent E. coli cells | Stratagene | 200314 |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 |
| Geneporter Transfection Reagent | Genlantis | T201007 |
| Leupeptin | Calbiochem | 108975 |
| MG132 | Calbiochem | 47491 |
| 10xPBS | Ambion | AM9625 |
| Protease inhibitor cocktail and PMSF | Santa Cruz Biotechnology | Sc-24948 |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 |
| anti-Myc tag (clone 4A6) agarose conjugate | Millipore | 16-219 |
| 2x loading buffer | BioRad | 161-0737 |
| Criterion Tris-HCl precast gel, 4-15% gradient | BioRad | 345-0028 |
| Immobilon-FL PVDF membrane | Millipore | IPFL00010 |
| Odyssey Blocking Buffer | LI-COR Biosciences | 927-40000 |
| 10xTBS | BioRad | 170-6435 |
| Rabbit anti-myc antibody | Cell signaling | 2272 |
| Goat anti-rabbit IRDye 800CW | LI-COR Biosciences | 926-32211 |
| Odyssey Imaging Infrared System | LI-COR Biosciences | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) | Thermo Scientific | 78430 |
References
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