Mutações no receptor kisspeptina (KISS1R) estão associados com distúrbios reprodutivos em pacientes. Aqui nós descrevemos como introduzir mutações de interesse na seqüência GC-rica de KISS1R, bem como o uso de construções KISS1R para caracterizar a via de degradação do receptor por imunoprecipitação e western blot
O receptor kisspeptina (KISS1R) é um receptor acoplado à proteína G reconhecido como o gatilho da puberdade e um regulador de competência reprodutiva na vida adulta 1,2,3. Mutações inativadoras no KISS1R identificados em pacientes têm sido associados com hipogonadismo hipogonadotrófico iodiopathic 1,2 (IHH) e puberdade precoce 4. Estudos funcionais destes mutantes são cruciais para nossa compreensão dos mecanismos subjacentes à regulação da reprodução por este receptor, bem como aqueles moldar a evolução das doenças, que resultam de sinalização KISS1R anormal e função. No entanto, a seqüência altamente GC-rica do gene KISS1R torna bastante difícil a introdução de mutações ou amplificar o gene que codifica este receptor pela PCR.
Aqui nós descrevemos um método para introduzir mutações de interesse para esta seqüência altamente GC-rica que tem sido utilizado com sucesso para gerar mais de uma dúzia de mutantes KISS1R em nosso laboratório. Nós otimizamos as condições de PCR para facilitar a ampliação de uma série de mutantes KISS1R que incluem substituições, supressões ou inserções na seqüência KISS1R. A adição de uma solução enhancer PCR, bem como de uma pequena porcentagem de DMSO foram especialmente úteis para melhorar a amplificação. Este procedimento otimizado pode ser útil para outras GC-rica modelos também.
O vetor de expressão que codifica a KISS1R está sendo usado para caracterizar a sinalização e função desse receptor, a fim de entender como as mutações podem mudar KISS1R função e levar a fenótipos associados reprodutiva. Assim, as aplicações potenciais de mutantes KISS1R gerados por mutagênese sítio-dirigida pode ser ilustrado por muitos estudos 1,4,5,6,7,8. Como exemplo, a mutação de ganho de função-nos KISS1R (Arg386Pro), que está associada com puberdade precoce, foi mostrado para prolongar a capacidade de resposta do receptor à estimulação ligante 4, bem como de alterar a taxa de degradação da KISS1R 9 . Curiosamente, nossos estudos indicam que KISS1R é degradada pelo proteassoma, em oposição à degradação lisossomal clássico descrito para a maioria das proteínas G-coupled receptors 9. No exemplo aqui apresentado, a degradação do KISS1R é investigada em células embrionárias do rim (HEK-293) transitoriamente expressando-Myc tag KISS1R (MycKISS1R) e tratados com inibidores de proteassoma ou lisossomos. Lisados celulares são immunoprecipitated agarose usando um conjugado anticorpo anti-myc seguido de western blot. Detecção e quantificação de MycKISS1R em blots é realizada utilizando o Sistema Odyssey LI-COR Infrared. Esta abordagem pode ser útil no estudo da degradação de outras proteínas de interesse também.
Sítio-dirigida mutagênese tem sido utilizado para estudar a função de proteínas através da introdução de mudanças de nucleotídeos na seqüência de codificação de genes alvo por mais de três décadas. A técnica original foi descrita em 1978 pelo químico britânico-canadense e Prêmio Nobel Michael Smith 10. Michael Smith dividiram o Prêmio Nobel de 1993 em Química com Kary Mullis, o bioquímico americano que inventou o Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) 11. O método original d…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi parcialmente financiado pelo Poder Reprodutiva do Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano (NICHD – R21 HD059015) e pela capa Charles H. Young Foundation Investigator Award Criança Pesquisa em Saúde (Boston, MA).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
10x PCRx Enhancer Solution | Invitrogen | 52391 |
PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase Alternative Detergent | Stratagene | 600385 |
Dpn-I | New England Biolabs | R0176 |
XL10-Gold Ultracompetent E. coli cells | Stratagene | 200314 |
DMEM | Cellgro | 10-013-CV |
Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 |
Geneporter Transfection Reagent | Genlantis | T201007 |
Leupeptin | Calbiochem | 108975 |
MG132 | Calbiochem | 47491 |
10xPBS | Ambion | AM9625 |
Protease inhibitor cocktail and PMSF | Santa Cruz Biotechnology | Sc-24948 |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 |
anti-Myc tag (clone 4A6) agarose conjugate | Millipore | 16-219 |
2x loading buffer | BioRad | 161-0737 |
Criterion Tris-HCl precast gel, 4-15% gradient | BioRad | 345-0028 |
Immobilon-FL PVDF membrane | Millipore | IPFL00010 |
Odyssey Blocking Buffer | LI-COR Biosciences | 927-40000 |
10xTBS | BioRad | 170-6435 |
Rabbit anti-myc antibody | Cell signaling | 2272 |
Goat anti-rabbit IRDye 800CW | LI-COR Biosciences | 926-32211 |
Odyssey Imaging Infrared System | LI-COR Biosciences | |
Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) | Thermo Scientific | 78430 |