Mutagénesis y análisis de mutaciones genéticas en la secuencia del receptor GC-ricos KISS1 identificado en el hombre con Trastornos del aparato reproductor
Summary
Las mutaciones en el receptor kisspeptina (KISS1R) se asocian con trastornos de la reproducción en los pacientes. A continuación se describe la forma de introducir las mutaciones de interés en la secuencia rica en GC de KISS1R, así como el uso de construcciones KISS1R para caracterizar la vía de degradación del receptor por inmunoprecipitación y Western Blot
Abstract
El receptor de kisspeptina (KISS1R) es una proteína G-receptor acoplado reconocido como el desencadenante de la pubertad y un regulador de la competencia reproductiva en la edad adulta 1,2,3. Inactivación de las mutaciones en KISS1R identificados en los pacientes han sido asociados con el hipogonadismo hipogonadotrópico iodiopathic (IHH) 1,2 y la pubertad precoz 4. Estudios funcionales de estos mutantes son cruciales para nuestra comprensión de los mecanismos que subyacen a la regulación de la reproducción de este receptor, así como los que dan forma los resultados de la enfermedad, que resultan de la señalización KISS1R anormal y la función. Sin embargo, la secuencia altamente rica en GC del gen KISS1R hace que sea bastante difícil de introducir mutaciones o amplificar el gen que codifica este receptor por PCR.
Aquí se describe un método para introducir mutaciones de interés en esta secuencia muy rica en GC que ha sido utilizado con éxito para generar más de una docena de mutantes KISS1R en nuestro laboratorio. Hemos optimizado las condiciones de PCR para facilitar la ampliación de una serie de mutantes KISS1R que incluyen sustituciones, eliminaciones o inserciones en la secuencia KISS1R. La adición de una solución de PCR potenciador, así como de un pequeño porcentaje de DMSO fueron especialmente útiles para mejorar la amplificación. Este procedimiento optimizado puede ser útil para otros GC-ricos y plantillas.
El vector de expresión que codifica la KISS1R se ha utilizado para caracterizar la señalización y la función de este receptor con el fin de entender cómo las mutaciones pueden cambiar KISS1R función y llevar a los fenotipos asociados reproductiva. En consecuencia, las posibles aplicaciones de los mutantes KISS1R generado por mutagénesis dirigida se puede ilustrar con muchos estudios 1,4,5,6,7,8. A modo de ejemplo, la mutación de ganancia de función en el KISS1R (Arg386Pro), que está asociada con la pubertad precoz, se ha demostrado que prolonga la capacidad de respuesta del receptor a la estimulación ligando 4, así como para alterar la velocidad de degradación de KISS1R 9 . Curiosamente, nuestros estudios indican que KISS1R se degrada por el proteasoma, a diferencia de la degradación lisosomal clásicos descritos para la mayoría de G receptores acoplados a proteínas 9. En el ejemplo que aquí se presenta, la degradación de la KISS1R se investiga en células de riñón embrionario humano (HEK-293) que expresan transitoriamente Myc-etiquetados KISS1R (MycKISS1R) y tratados con inhibidores del proteasoma o lisosomas. Lisados celulares se immunoprecipitated agarosa usando un conjugado de anticuerpos anti-myc seguido por análisis de Western blot. Detección y cuantificación de MycKISS1R en transferencias se realiza mediante el sistema Odyssey LI-COR infrarrojos. Este enfoque puede ser útil en el estudio de la degradación de otras proteínas de interés.
Protocol
Discussion
Mutagénesis dirigida se ha utilizado para estudiar la función de proteínas mediante la introducción de cambios de nucleótidos en la secuencia de codificación de los genes blanco de más de tres décadas. La técnica original fue descrita en 1978 por el químico británico-canadiense y ganador del Premio Nobel Michael Smith 10. Michael Smith compartió el 1993 Premio Nobel de Química con Kary Mullis, el bioquímico estadounidense que inventó la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 11. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado parcialmente por el Poder Reproductiva del Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano (NICHD – R21 HD059015) y el Premio Charles H. Hood Foundation Niño Pequeño Investigador Investigación en Salud (Boston, MA).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| 10x PCRx Enhancer Solution | Invitrogen | 52391 |
| PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase Alternative Detergent | Stratagene | 600385 |
| Dpn-I | New England Biolabs | R0176 |
| XL10-Gold Ultracompetent E. coli cells | Stratagene | 200314 |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 |
| Geneporter Transfection Reagent | Genlantis | T201007 |
| Leupeptin | Calbiochem | 108975 |
| MG132 | Calbiochem | 47491 |
| 10xPBS | Ambion | AM9625 |
| Protease inhibitor cocktail and PMSF | Santa Cruz Biotechnology | Sc-24948 |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 |
| anti-Myc tag (clone 4A6) agarose conjugate | Millipore | 16-219 |
| 2x loading buffer | BioRad | 161-0737 |
| Criterion Tris-HCl precast gel, 4-15% gradient | BioRad | 345-0028 |
| Immobilon-FL PVDF membrane | Millipore | IPFL00010 |
| Odyssey Blocking Buffer | LI-COR Biosciences | 927-40000 |
| 10xTBS | BioRad | 170-6435 |
| Rabbit anti-myc antibody | Cell signaling | 2272 |
| Goat anti-rabbit IRDye 800CW | LI-COR Biosciences | 926-32211 |
| Odyssey Imaging Infrared System | LI-COR Biosciences | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) | Thermo Scientific | 78430 |
References
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