Mutagenes och analys av genetiska mutationer i GC-rika KISS1 Receptor Sekvens identifierats hos människa med störningar i fortplantningsorganen
Summary
Mutationer i kisspeptin receptorn (KISS1R) är associerade med reproduktionsstörningar hos patienter. Här beskriver vi hur man kan införa mutationer av intresse för GC-rika sekvens av KISS1R samt användning av KISS1R konstruktioner att karakterisera nedbrytningsvägen av receptorn genom immunoprecipitation och Western Blot
Abstract
Den kisspeptin receptor (KISS1R) är en G-proteinkopplade receptor erkänd som utlöser av puberteten och en regulator av reproduktiv kompetens i vuxen ålder 1,2,3. Inaktiverande mutationer i KISS1R identifierats hos patienter som har förknippats med iodiopathic hypogonadotropic hypogonadism (IHH) 1,2 och tidig pubertet 4. Funktionella studier av dessa mutanter är avgörande för vår förståelse av mekanismerna bakom regleringen av reproduktionen av denna receptor samt de forma sjukdomsföljder, till följd av onormala KISS1R signalering och funktion. Men gör den mycket GC-rika sekvensen av KISS1R genen det ganska svårt att införa mutationer eller förstärka kodar denna receptor med PCR.
Här beskriver vi en metod för att introducera mutationer av intresse i denna mycket GC-rika sekvens som har använts framgångsrikt för att generera mer än en mutanter dussin KISS1R i vårt laboratorium. Vi har optimerat PCR-förhållanden för att underlätta förstärkningen av en rad KISS1R mutanter som inkluderar ersätta, stryka eller införanden i KISS1R sekvens. Tillägget av en PCR-förstärkare lösning, samt en liten del av DMSO var speciellt användbart för att förbättra förstärkning. Detta optimerade proceduren kan vara användbar för andra GC-rika mallar också.
Uttrycket Vektorn kodar för KISS1R är använts för att karaktärisera signalering och funktion av denna receptor för att förstå hur mutationer kan ändra KISS1R funktion och leda till tillhörande reproduktiva fenotyper. Därför kan potentiella tillämpningar KISS1R mutanter som genereras av plats riktad mutagenes kan illustreras av många studier 1,4,5,6,7,8. Som ett exempel har gain-of-funktion mutation i KISS1R (Arg386Pro), som är förknippade med tidig pubertet, har visats förlänga lyhördhet av receptorn till ligand stimulering 4 samt ändra nedbrytningshastigheten hos KISS1R 9 . Intressant, våra studier visar att KISS1R bryts ned av proteasom, i motsats till den klassiska lysosomalt nedbrytning beskrivs för de flesta G-proteinkopplade receptorer 9. I exemplet som presenteras här är nedbrytning av KISS1R undersökts i humana embryonala njur celler (HEK-293) övergående uttrycker Myc-märkta KISS1R (MycKISS1R) och behandlas med proteasom eller lysosome hämmare. Cell lysates är immunoprecipitated med en agaros-konjugerat anti-Myc antikropp följt av Western Blot analys. Påvisande och kvantifiering av MycKISS1R på blots utförs med hjälp av LI-COR Odyssey IR System. Denna metod kan vara användbar i studiet av nedbrytning av andra proteiner av intresse också.
Protocol
Discussion
Site-directed mutagenes har använts för att studera proteiners funktion genom att införa nukleotid förändringar i kodande sekvens av riktade gener i över tre decennier. Den ursprungliga tekniken beskrevs 1978 av den brittisk-kanadensiska kemist och nobelpristagaren Michael Smith 10. Michael Smith delade 1993 Nobelpriset i kemi med Kary Mullis, den amerikanska Biokemisten som uppfann polymeraskedjereaktion (PCR) 11. Den ursprungliga metod som beskrivs av Michael Smith har förbättrats under ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har delvis finansierats av reproduktiv förgrena sig av det nationella institutet för barns hälsa och mänsklig utveckling (NICHD – K21 HD059015) och av Charles H. Hood Foundation Young Investigator Child Health Research Award (Boston, MA).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| 10x PCRx Enhancer Solution | Invitrogen | 52391 |
| PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase Alternative Detergent | Stratagene | 600385 |
| Dpn-I | New England Biolabs | R0176 |
| XL10-Gold Ultracompetent E. coli cells | Stratagene | 200314 |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 |
| Geneporter Transfection Reagent | Genlantis | T201007 |
| Leupeptin | Calbiochem | 108975 |
| MG132 | Calbiochem | 47491 |
| 10xPBS | Ambion | AM9625 |
| Protease inhibitor cocktail and PMSF | Santa Cruz Biotechnology | Sc-24948 |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 |
| anti-Myc tag (clone 4A6) agarose conjugate | Millipore | 16-219 |
| 2x loading buffer | BioRad | 161-0737 |
| Criterion Tris-HCl precast gel, 4-15% gradient | BioRad | 345-0028 |
| Immobilon-FL PVDF membrane | Millipore | IPFL00010 |
| Odyssey Blocking Buffer | LI-COR Biosciences | 927-40000 |
| 10xTBS | BioRad | 170-6435 |
| Rabbit anti-myc antibody | Cell signaling | 2272 |
| Goat anti-rabbit IRDye 800CW | LI-COR Biosciences | 926-32211 |
| Odyssey Imaging Infrared System | LI-COR Biosciences | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) | Thermo Scientific | 78430 |
References
- Seminara, S. B., Messager, S., Chatzidaki, E. E. The GPR54 Gene as a Regulator of Puberty. N Engl J Med. 349, 1614-1627 (2003).
- de Roux, N., Genin, E., Carel, J. C. Hypogonadotropic Hypogonadism Due to Loss of Function of the KiSS1-Derived Peptide Receptor GPR54. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 10972-10976 (2003).
- Messager, S., Chatzidaki, E. E., Ma, D. Kisspeptin Directly Stimulates Gonadotropin-Releasing Hormone Release via G Protein-Coupled Receptor 54. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1761-1766 (2005).
- Teles, M. G., Bianco, S. D., Brito, V. N. A GPR54-Activating Mutation in a Patient with Central Precocious Puberty. N Engl J Med. 358, 709-715 (2008).
- Tenenbaum-Rakover, Y., Commenges-Ducos, M., Iovane, A. Neuroendocrine Phenotype Analysis in Five Patients with Isolated Hypogonadotropic Hypogonadism due to a L102P Inactivating Mutation of GPR54. J Clin Endocrinol Metab. 92, 1137-1144 (2007).
- Semple, R. K., Achermann, J. C., Ellery, J. Two Novel Missense Mutations in G Protein-Coupled Receptor 54 in a Patient with Hypogonadotropic Hypogonadism. J Clin Endocrinol Metab. 90, 1849-1855 (2005).
- Wacker, J. L., Feller, D. B., Tang, X. B. Disease-Causing Mutation in GPR54 Reveals the Importance of the Second Intracellular Loop for Class A G-Protein-Coupled Receptor Function. J Biol Chem. 283, 31068-31078 (2008).
- Szereszewski, J. M., Pampillo, M., Ahow, M. R. GPR54 regulates ERK1/2 activity and hypothalamic gene expression in a Galpha(q/11) and beta-arrestin-dependent manner. PLoS One. 5, e12964-e12964 (2010).
- Bianco, S. D. C., Vandepas, L., Correa-Medina, M., Gereben, B., Mukherjee, A., Kuohung, W., Carroll, R., Teles, M. G., Latronico, A. C., Kaiser, U. B. KISS1R Intracellular Trafficking and Degradation: Effect of the Arg386Pro Disease-Associated Mutation. Endocrinology. , (2011).
- Hutchison, C. A., Phillips, S., Edgell, M. H. Mutagenesis at a Specific Position in a DNA Sequence. J Biol Chem. 253, 6551-6560 (1978).
- Mullis, K. B. The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction. Sci Am. 262, 56-61 (1990).
- Henke, W., Herdel, K., Jung, K., Schnorr, D., Loening, S. A. Betaine improves the PCR amplification of GC-rich DNA sequences. Nucleic Acids Res. 25, 3957-3958 (1997).
- Sahdev, S., Saini, S., Tiwari, P., Saxena, S., Singh Saini, K. Amplification of GC-rich genes by following a combination strategy of primer design, enhancers and modified PCR cycle conditions. Mol Cell Probes. 21, 303-307 (2007).
- Kong, K. C., Poyner, D. R., Wheatly, M. Chapter 10. MSTA. in G Protein-Coupled Receptors: Essential Methods. , 197-204 (2010).
- Hall, R. A., George, S. R., O’Dowd, B. F. Chapter 9. G protein-Coupled Receptor-Protein Interactions. , 170-171 (2005).
- Chaturvedi, K., Bandari, P., Chinen, N., Howells, R. D. Proteasome Involvement in Agonist-Induced Down-Regulation of Mu and Delta Opioid Receptors. J Biol Chem. 276, 12345-12355 (2001).
- Shenoy, S. K., McDonald, P. H., Kohout, T. A., Lefkowitz, R. J. Regulation of Receptor Fate by Ubiquitination of Activated Beta 2-Adrenergic Receptor and Beta-Arrestin. Science. 294, 1307-1313 (2001).
