Summary
Microiontophorèse entraîne le mouvement des ions à partir d'une micropipette en réponse à une différence de potentiel électrique entre l'intérieur et l'extérieur de la micropipette. Molécules biologiquement actives sont ainsi livrées en proportion de courant électrique. Nous illustrons microiontophorèse acétylcholine en conjonction avec micromanipulation pour étudier endothélium-dépendante la vasodilatation de la microcirculation.
Abstract
Microiontophorèse implique le passage du courant à travers une pointe de micropipette pour livrer un soluté dans un site désigné au sein d'une préparation expérimentale. Microiontophorèse peut simuler une transmission synaptique en offrant neurotransmetteurs et des neuropeptides sur les neurones de façon reproductible 2. Volume négligeable (fluide) évite le déplacement des perturbations mécaniques pour la préparation expérimentale. Adapter ces techniques pour la microcirculation 3 a permis à des mécanismes de la vasodilatation et la vasoconstriction d'être étudiée au niveau microscopique in vivo 4,5. Un avantage clé de la prestation est localisée permettant réponses vasomotrices d'être étudié sur des sites définis au sein d'un réseau microvasculaire sans évoquer les changements systémiques ou réflexive de la tension artérielle et la circulation sanguine des tissus, révélant ainsi des propriétés intrinsèques des microvaisseaux.
Une limitation de microiontophorèse est que la concentration précise de l'agent livré sur le site d'intérêt est difficile à déterminer 6. Néanmoins, sa sortie de la pointe de micropipette est proportionnelle à l'intensité et la durée de l'éjection actuelle 2,7, de sorte que reproductibles relations stimulus-réponse peut être facilement déterminée sous des conditions expérimentales définies (décrites ci-dessous). D'autres facteurs influant sur la prestation microiontophoretic comprennent concentration en soluté et son ionisation en solution. Le diamètre interne de l'embout micropipette devrait être ~ 1 mm ou moins à minimiser diffusionnels «fuite», qui peut être contrarié avec un courant de retenue. Ainsi, un étranger (positif) actuelle est utilisée pour éjecter un cation et un courant négatif utilisé pour le conserver au sein de la micropipette.
La fabrication des micropipettes est facilitée avec extracteurs sophistiqués électronique 8. Micropipettes sont tirés de tubes capillaires en verre contenant un filament que «mèches» solution dans l'embout de la micropipette quand il est rempli de l'extrémité arrière («remblayer»). Cela se fait par l'insertion d'un tube microcapillaire reliée à une seringue contenant la solution de l'intérêt et l'éjection de la solution dans la lumière de la micropipette. Micromanipulateurs permettent de placement souhaitée de micropipettes au sein de la préparation expérimentale. Micromanipulateurs monté sur une base mobile peut être positionnée autour de la préparation selon la topographie des réseaux microvasculaires (développé ci-dessous).
Le présent protocole démontre microiontophorèse de l'acétylcholine (ACh + Cl -) sur une artériole de la préparation de la souris crémaster (Voir associés protocole: ID # 2874 JoVE) pour produire endothélium-dépendante vasodilatation. La livraison de stimulation est synchronisée avec l'acquisition d'images numérisées à l'aide d'un déclencheur électronique. L'utilisation de BAC-CX40 GCaMP2 9 souris transgéniques permet la visualisation des réponses calcium intracellulaire qui sous-tendent la vasodilatation artériolaire dans les cellules endothéliales de la microcirculation de vie.
Protocol
1. Soins des animaux et l'utilisation
Après examen et l'approbation de l'Institutional Animal Care et le Comité de l'utilisation, la souris mâle au moins 12 semaines sont utilisées. Une souris est anesthésiés avec du pentobarbital sodique (60 mg / kg) par voie intrapéritonéale (IP) d'injection. Tout au long des procédures chirurgicales et des protocoles expérimentaux, l'anesthésie est maintenue par des suppléments (10-20% de l'injection initiale, ip) comme il faut (toutes les 30-60 minutes; indiqué par réaction de retrait à l'orteil ou de pincer la queue). Après achèvement de la procédure expérimentale de la souris est une overdose avec du pentobarbital (ip) et euthanasiés par dislocation cervicale.
2. Micropipettes et microiontophorèse
- Micropipettes microiontophorèse (diamètre de l'extrémité interne, ~ 1 um) sont préparés à partir de tubes de verre borosilicate capillaire en utilisant un extracteur de pipette horizontale. Ours ont une conicité ~ 5 mm pour la rigidité; plus cierges sont plus souples.
- Micropipettes sont remblayés avec 1M ACh (Figure1A-C) dissous dans l'eau 18,2 MQ. Pour le remblayage, un tube microcapillaire est connecté à filtre de 0,2 um couplée à une seringue contenant l'agoniste d'intérêt (figure 1). Ceux-ci peuvent être facilement fabriqués (ci-dessous) ou achetés auprès de fournisseurs commerciaux. Le tube microcapillaire est inséré dans l'extrémité arrière de la solution micropipette et ACh est livré dans la lumière tout en retirant le tube microcapillaire que la micropipette comble. En tenant la micropipette avec son extrémité pointant vers le bas, les bulles d'air sont éliminées par un léger effleurant la micropipette.
- La micropipette est fixée dans un support monté dans un micromanipulateur (figure 2). Le titulaire dispose d'un fil d'argent reliant la solution d'ACh dans la micropipette d'une broche externe, qui à son tour est relié à la borne positive d'un programmeur microiontophorèse. Un fil d'argent seconde déposés au bord de la préparation des tissus est connecté à la borne négative pour compléter le circuit de la pointe de la micropipette est avancé dans la solution de sérum physiologique au cours de la préparation.
- Un courant de retenue est appliquée pour empêcher la vasodilatation (ou réponse fluorescente) lorsque la pointe micropipette est positionné adjacent à la paroi artériolaire. Conserver actuelle variera en fonction de la taille de la pointe micropipette (diamètre intérieur = 1 um) et la concentration agoniste mais il est hautement reproductible pour les paramètres définis (nous utilisons ~ 200 nA pour 1M ACh, une astuce um). Le courant en conservant cesse coïncide avec la livraison d'éjection courant via la gâchette électronique (Figure 1 supplémentaire) synchronisée avec l'apparition de l'acquisition d'images.
3. Micromanipulation
- Une plate-forme personnalisée pour une platine de microscope XY a été fabriqué en acier inoxydable ferromagnétiques. Dimensions plate-forme (1 / 8 "x 12" x 13 ") permettent un espace suffisant pour micromanipulateurs position autour de la préparation expérimentale Micromanipulateurs désirée (figure 2A). Sécurisé aux bases magnétiques (figure 2B) permettent le positionnement comme dicté par la préparation. Ce sont placé directement sur la plate-forme fabriquée autour de la préparation pour micropipettes positionnement sur les sites d'intérêt (figure 2C).
4. Les résultats représentatifs
- Avec la pointe micropipette positionnée adjacente à une artériole, il est la réponse de fluorescence à l'ACh (en conservant courant que ajustées pour empêcher la fuite d'ACh). Ci-dessous un stimulus seuil n'y avait aucun effet. Cependant, comme l'intensité du stimulus augmenté, endothéliales de fluorescence du calcium cellulaire accrue sur des distances progressivement plus long de l'artériole, comme l'intensité de la fluorescence sur le site de la stimulation (figure 3).
Figure 1. Méthode pour le remblayage des pipettes microiontophorèse. A) Un tube microcapillaire (flèche verte) est fixé dans un raccord de compression (flèche bleue) attaché à un filtre de 0,2 um (flèche violette) qui est ensuite attachée à une seringue remplie d'1M d'ACh. B) Le tube microcapillaire est introduit dans le pipette microiontophorèse travers l'arrière et la solution est déplacé pour remplir la lumière de la micropipette. C) Une fois la pipette est remplie, maintenez la pointe vers le bas et tapotez doucement au-dessus du cône pour éliminer les bulles (flèche noire).
Figure 2. Plate-forme personnalisée pour le placement micromanipulateur. .. A) Une plate-forme en acier inoxydable ferromagnétiques a été placé sur une coutume MVX10 base de microscope contenant une platine XY translationnelle B) Circulaire bases magnétiques apposée au bas de compacte à 3 axes micromanipulateurs C) Micromanipulateurs positionné autour de la préparation expérimentale (voir protocole associé: ID # 2874 JoVE) pour l'étude des sites d'intérêt spécifique. L'ir taille compacte et sa polyvalence permettent micropipettes multiples pour être utilisés simultanément.
Figure 3. Fluorescence de calcium dans les artérioles. Fluorescence de calcium des cellules endothéliales tapissant la paroi artériolaire augmente avec l'intensité du stimulus. Les 3 premiers panneaux montré des images des réponses de fluorescence à A) 250 nA, B) 500 nA et C) 1000 nA l'éjection de courant (tous les 500 ms durée d'impulsion). La distance sur laquelle la fluorescence endothéliales de calcium cellulaire accrue est indiqué par des crochets dans le CA (~ 130, 270 et 400 um, respectivement). La ligne de référence à travers l'artériole dans chaque panneau indique où les réponses de fluorescence (F / Fo) à l'ACh ont été enregistrées sur le site de la stimulation. D) Les enregistrements de F / Fo temps vs pour des stimuli ACh augmente. Comme d'éjection courant a augmenté, F / Fo augmenté en amplitude et en durée. Notez que 100 nA de relance était en dessous du seuil et n'a eu aucun effet.
Figure 1 supplémentaire. Schéma pour déclenchement électronique. Ce circuit est interfacé avec un port parallèle à partir d'un ordinateur personnel. Lorsque activé, il fournit une constante impulsion TTL de 5V. La puce 7805 est un régulateur de tension 5V connecté à une alimentation 9-12V DC (une batterie de tension appropriée est très bien). La sortie de la 7805 fournit la puissance à l'interrupteur de quad bilatérales et à la sortie du circuit. Entrée à travers la résistance 1K est de l'ordinateur.
Discussion
Le protocole décrit ici démontre des méthodes pour préparer et mettre en œuvre pour micropipettes microiontophorèse. Livraison de l'acétylcholine est utilisé pour illustrer la signalisation calcique sous-jacente vasodilatation endothélium-dépendante dans les artérioles de la souris anesthésiée. Nos résultats montrent que la distance sur laquelle l'ACh augmente endothéliales cellule augmente de calcium par fluorescence avec l'intensité du courant de l'éjection de la micropipette microiontophorèse (figure 3). L'absence d'augmentation de fluorescence dans des conditions de repos indique une fuite négligeable de l'ACh à partir de la micropipette. L'absence de réponse de 100 nA intensité du stimulus (figure 3, la légende) montre que l'intensité du seuil de stimulation est nécessaire pour le calcium des cellules endothéliales d'augmenter. Ces techniques peuvent être facilement adaptée à d'autres agents vasoactifs et de préparations de tissus.
Des considérations pratiques: En travaillant avec d'étudier la réactivité microiontophorèse artériolaire, plusieurs choses doivent être reconnus. Alors il s'est avéré difficile de déterminer la concentration réelle de l'agoniste de livraison, de stimulus-réponse courbes sont reproductibles à l'intérieur et entre les préparations. Ceux-ci peuvent être effectuées en tenant durée d'impulsion constante (par exemple, 500 ms) et en variant l'éjection de courant (par exemple, 250, 500 et 1000 NA; figure 3). Alternativement, l'éjection de courant peut être maintenu constant (par exemple, 500 nA) et la durée d'impulsion variés (par exemple, 250, 500 et 1000 ms). Pour une référence à l'action d'une concentration d'agoniste défini, la préparation peut être perfusées avec la solution appropriée 5. Parce que la force motrice de l'éjection soluté est le mouvement de charge électrique, l'agent d'être livré doit porter une charge nette d'être déplacés de la micropipette. Afin de s'assurer que l'agent d'intérêt est le porteur de charge primaire, il est dissous à une concentration élevée (par exemple, 1 M pour l'ACh) pour minimiser l'électro-osmose. Lorsque cela nécessite de manipuler le pH de la solution de remplissage micropipette, les contrôles de véhicules sont tenus d'établir tous les effets non spécifiques. Des contrôles appropriés doivent aussi être effectués pour le passage du courant seul (par exemple, en utilisant des micropipettes remplies de solution saline isotonique). La distance efficace pour la diffusion de l'agent de son site de libération doit être déterminée et est plus facilement déterminée empiriquement par la disparition d'une réponse physiologique (par exemple, la vasodilatation ou une augmentation du calcium intracellulaire lors de l'éjection de l'ACh) comme la micropipette est positionné à défini distances du site cible. En pratique, la distance de diffusion efficace est grandement influencée par la manière dont la pointe de la micropipette est positionné dans le tissu, par exemple si la pointe enfoncée dans le tissu et son extrémité est obstruée, que l'éjection est altérée. Excessive de tissu conjonctif est particulièrement gênant et devrait être retiré de la surface du tissu lors de la préparation chirurgicale. Une attention particulière devrait également être accordée à la possibilité d'épuiser la pointe de l'agent désigné. Ceci est minimisé en utilisant des impulsions relativement courtes (par exemple, ≤ 1 s). Avec des courants soutenus (par exemple, plusieurs secondes), l'agoniste peut être expulsé de la pointe plus rapidement qu'elle ne peut être remplacée par la diffusion de la solution en vrac de remplir la micropipette.
Parce volume négligeable est déplacée par microiontophorèse, si l'on essaie de changer le milieu local ioniques (par exemple, de livrer un K dépolarisants relance +), cela ne peut être efficacement réalisé avec microiontophorèse mais il est facilement atteint avec l'éjection de pression de liquide en vrac ayant le désiré composition. Pour la stimulation locale d'une artériole, conseils micropipette avec un diamètre intérieur de 2-3 um bien travailler avec la pression d'éjection 4-5 psi (28-35 kPa) et la durée d'impulsion (par exemple, 1 seconde) contrôlée par une électrovanne 10. Si la livraison soutenue d'un agent d'une micropipette sur une microvaisseaux est nécessaire, l'éjection pression est préféré à l'aide des micropipettes diamètre de l'extrémité interne appropriée (par exemple, ~ 10 mm) 11,12. Une colonne hydrostatique de hauteur connue avec une vanne robinet fournit un moyen peu coûteux, bien définie sur / la tête de pression constante. Les débits sont déterminés par le diamètre interne de la pointe de la pipette et la pression de conduite. Comme toujours, les contrôles de véhicules sont indispensables pour exclure les actions non spécifiques de l'éjection de pression.
Disclosures
Toutes les procédures et les protocoles impliquant des animaux ont été approuvés par le Comité de protection des animaux et de l'utilisation de l'Université du Missouri et réalisée en accord avec le Guide National Institutes of Health pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire. La production de cet article a été parrainé par Stanford Photonics.
Acknowledgments
La recherche en laboratoire des auteurs est soutenu par le National Institutes of Health subventions R37-HL041026, R01 et R01-HL086483-HL056786 (SSS) et par F32-HL097463 et T32-AR048523 (PB) du Service des Etats-Unis santé publique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Borosilicate Glass Capillary Tubes | Warner Instruments | GC120F-10 | |
| Horizontal Pipette Puller | Sutter Instrument Co. | model P-97 | |
| Acetylcholine Chloride | Sigma-Aldrich | A6625 | |
| adapter for Luer hub | Martech | AC1343 | To secure microcapillary tubing |
| 0.2 μm Nylon Titan filter | Sun Sri | 42204-NN | Low retention volume to minimize loss |
| 5 ml syringe | BD Biosciences | 309603 | |
| Pipette Holder | Warner Instruments | E45W-M12VH | |
| Silver Wire | Warner Instruments | AG10W | 0.25mm diameter |
| 3-axis micromanipulator | Siskiyou, Inc. | DT3-100, MXB, MXC, MGB/8 | Components for manipulator as shown |
| microiontophoresis current programmer | World Precision Instruments, Inc. | Model 260 | |
| trigger device | Custom | custom | circuit provided in Suppl. Figure 1 |
| stainless steel plate | McMaster-Carr | 1/8" X 12" X 12" | According to design |
| Intensified Digital Camera | Stanford Photonics Inc | XR/Mega-10 | Integrated with Piper Control software |
References
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