Summary
Microiontophoresis और micropipette के अंदर और बाहर के बीच विद्युत क्षमता में एक फर्क करने के लिए जवाब में एक micropipette से आयनों के आंदोलन की जरूरत पर जोर देता है. Biologically सक्रिय अणुओं जिससे मौजूदा बिजली के अनुपात में वितरित कर रहे हैं. हम microcirculation में endothelium निर्भर vasodilation अध्ययन micromanipulation के साथ संयोजन के रूप में acetylcholine microiontophoresis वर्णन.
Protocol
1. पशु देखभाल और उपयोग
समीक्षा और संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति से अनुमोदन के बाद, पुरुष कम से कम 12 सप्ताह पुरानी चूहों का इस्तेमाल किया जाता है. Intraperitoneal इंजेक्शन (आईपी) के माध्यम से pentobarbital सोडियम (60 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ एक माउस anesthetized है. शल्यचिकित्सा की प्रक्रियाओं और प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के दौरान संज्ञाहरण (प्रारंभिक इंजेक्शन के 10-20%, आईपी) की खुराक के रूप में की जरूरत है (, वापसी पैर के अंगूठे या पूंछ चुटकी के जवाब संकेत द्वारा हर 30-60 मिनट) के द्वारा बनाए रखा है. प्रयोगात्मक प्रक्रिया के पूरा होने के बाद माउस के साथ (आईपी) pentobarbital और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा euthanized overdosed है.
2. Micropipettes और Microiontophoresis
- Microiontophoresis micropipettes (आंतरिक टिप व्यास, ~~ 1 सुक्ष्ममापी) borosilicate ग्लास केशिका ट्यूबों का उपयोग कर एक क्षैतिज विंदुक खींचने से तैयार हैं. हमारा एक ~ कठोरता के लिए 5 मिमी घटना है, अब tapers अधिक लचीला कर रहे हैं.
- Micropipettes 1M (Figure1A सी) ACH MΩ 18.2 पानी में भंग के साथ backfilled हैं. Backfilling के लिए, एक microcapillary ट्यूब 0.2 सुक्ष्ममापी ब्याज के agonist (चित्रा 1) से युक्त सिरिंज के लिए मिलकर फिल्टर करने के लिए जुड़ा हुआ है. ये आसानी से हो सकता है (नीचे) गढ़े कर सकते हैं या वाणिज्यिक विक्रेताओं से खरीदे गए. microcapillary ट्यूब micropipette और ACH समाधान लुमेन में वितरित किया जाता है जबकि microcapillary ट्यूब वापस लेने के रूप में micropipette भरता के पीछे के अंत में डाला जाता है. नीचे ओर इशारा करते टिप के साथ micropipette होल्डिंग, हवाई बुलबुले धीरे micropipette flicking द्वारा हटा दिया जाता है.
- micropipette एक एक micromanipulator (चित्रा 2) में मुहिम शुरू की धारक में सुरक्षित है. धारक एक रजत micropipette के भीतर एक बाहरी पिन, जो बारी में एक microiontophoresis प्रोग्रामर के सकारात्मक टर्मिनल से जुड़ा है ACH समाधान को जोड़ने तार किया है. एक दूसरे चांदी के ऊतक की तैयारी के किनारे पर सुरक्षित तार नकारात्मक टर्मिनल के लिए जुड़ा हुआ है सर्किट को पूरा करने के रूप में micropipette की नोक शारीरिक नमकीन घोल में तैयारी से अधिक उन्नत है.
- एक को बनाए रखना वर्तमान vasodilation को रोकने के (या फ्लोरोसेंट प्रतिक्रिया) जब micropipette टिप arteriolar दीवार के निकट तैनात है के लिए लागू किया जाता है. वर्तमान बनाए रखने micropipette (आंतरिक व्यास = 1 सुक्ष्ममापी) टिप और agonist एकाग्रता के आकार के साथ अलग अलग है लेकिन परिभाषित मापदंडों (हम 1M ACH, 1 सुक्ष्ममापी टिप के लिए ~ 200 NA का उपयोग करें) के लिए अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है. बनाए रखना है वर्तमान इंजेक्शन की छवि अधिग्रहण की शुरुआत के साथ सिंक्रनाइज़ इलेक्ट्रॉनिक ट्रिगर (पूरक चित्रा 1) के माध्यम से प्रसव के वर्तमान के साथ संपाती रहता है.
3. Micromanipulation
- एक XY खुर्दबीन चरण के लिए एक कस्टम मंच ferromagnetic स्टेनलेस स्टील के गढ़े किया गया था. प्लेटफार्म आयाम (1 / 8 "एक्स 12" 13 एक्स ") (2A चित्रा) वांछित. Micromanipulators चुंबकीय अड्डों (चित्रा 2B) के रूप में तैयारी के द्वारा तय पोजीशनिंग सक्षम करने के लिए सुरक्षित के रूप में प्रयोगात्मक तैयारी के आसपास स्थिति micromanipulators के लिए पर्याप्त जगह सक्षम ये हैं. गढ़े मंच पर सीधे ब्याज की साइटों (चित्रा 2C) पर स्थिति micropipettes के लिए तैयारी के आसपास रखा गया है.
4. प्रतिनिधि परिणाम
- साथ micropipette टिप एक arteriole के निकट तैनात, ACH को प्रतिदीप्ति प्रतिक्रिया (बनाए रखना है वर्तमान की तुलना में ACH रिसाव को रोकने के समायोजित) है. दहलीज उत्तेजना नीचे वहाँ कोई प्रभाव नहीं था. हालांकि, के रूप में उत्तेजना तीव्रता बढ़, endothelial सेल कैल्शियम प्रतिदीप्ति arteriole साथ उत्तरोत्तर अधिक से अधिक दूरी पर वृद्धि हुई है, के रूप में उत्तेजना की साइट (चित्रा 3) में प्रतिदीप्ति की तीव्रता किया.
चित्रा 1. Microiontophoresis pipettes Backfilling के लिए विधि. ए) एक microcapillary ट्यूब (हरा तीर) एक संपीड़न फिटिंग (नीले तीर) एक 0.2 फिल्टर सुक्ष्ममापी (बैंगनी तीर) जो तब एक 1M ACH से भरा एक सिरिंज के साथ संलग्न है संलग्न में सुरक्षित है). बी microcapillary ट्यूब में खिलाया है microiontophoresis विंदुक वापस अंत और समाधान के माध्यम से सी. micropipette के लुमेन भरने विस्थापित है) एक बार विंदुक भरा है, टिप नीचे पकड़ और धीरे शंकु ऊपर झटका बुलबुले (काला तीर ) को हटाने.
चित्रा 2. Micromanipulator नियुक्ति के लिए कस्टम प्लेटफार्म. ए) एक ferromagnetic स्टेनलेस स्टील मंच एक कस्टम MVX10 खुर्दबीन एक XY translational चरण युक्त आधार पर रखा गया था बी) परिपत्र चुंबकीय अड्डों कॉम्पैक्ट 3 अक्ष micromanipulators के नीचे चिपका सी) प्रयोगात्मक तैयारी के आसपास तैनात Micromanipulators (संबद्ध प्रोटोकॉल देखें : जौव आईडी २,८७४ #) हित के विशिष्ट साइटों का अध्ययन करने के लिए.ir कॉम्पैक्ट आकार और बहुमुखी प्रतिभा एकाधिक micropipettes एक साथ इस्तेमाल किया जा करने के लिए सक्षम है.
चित्रा 3. Arterioles में कैल्शियम प्रतिदीप्ति. Arteriolar दीवार अस्तर endothelial कोशिकाओं की कैल्शियम प्रतिदीप्ति उत्तेजना तीव्रता के साथ वृद्धि हुई है. पहले तीन पैनलों प्रतिदीप्ति प्रतिक्रियाओं का ए) 250 NA बी, छवियाँ) से पता चला 500 NA और सी) 1000 NA वर्तमान इंजेक्शन (सभी 500 एमएस स्पंद अवधि). दूरी जिस पर endothelial सेल कैल्शियम प्रतिदीप्ति बढ़ एसी (~ 130, 270 और 400 सुक्ष्ममापी, क्रमशः) में कोष्ठक ने संकेत दिया है. प्रत्येक पैनल में arteriole भर संदर्भ रेखा इंगित करता है जहाँ ACH को प्रतिदीप्ति प्रतिक्रियाओं (एफ / एफओ) उत्तेजना की साइट पर दर्ज किए गए. बढ़ती ACH उत्तेजनाओं के लिए) डी एफ / एफओ बनाम समय की रिकॉर्डिंग. वर्तमान इंजेक्शन के रूप में वृद्धि हुई है, एफ / एफओ आयाम और अवधि में वृद्धि हुई है. ध्यान दें कि 100 NA उत्तेजना सीमा से नीचे था और कोई प्रभाव नहीं पड़ा.
पूरक चित्रा 1. ट्रिगर के लिए इलेक्ट्रॉनिक सर्किट आरेख. यह सर्किट एक व्यक्तिगत कंप्यूटर से एक समानांतर बंदरगाह के साथ interfaced है . सक्रिय जब यह 5V के एक निरंतर टीटीएल नाड़ी प्रदान करता है. 7805 चिप 9-12V डीसी बिजली की आपूर्ति (उचित वोल्टेज के एक बैटरी ठीक है) से जुड़े एक 5V वोल्टेज नियामक है. 7805 से आउटपुट चौकोर द्विपक्षीय स्विच और सर्किट के उत्पादन में के लिए शक्ति प्रदान करता है. 1K रोकनेवाला भर इनपुट कंप्यूटर से है.
Discussion
यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल microiontophoresis लिए micropipettes तैयारी और क्रियान्वयन के लिए तरीकों को दर्शाता है. Acetylcholine की डिलिवरी anesthetized माउस के arterioles में कैल्शियम संकेत अंतर्निहित endothelium निर्भर vasodilation वर्णन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. हमारे परिणाम का वर्णन है कि जिस पर दूरी ACH microiontophoresis micropipette (चित्रा 3) से वर्तमान इंजेक्शन की तीव्रता के साथ endothelial सेल कैल्शियम प्रतिदीप्ति बढ़ जाती है बढ़ जाती है. आराम की शर्तों के तहत प्रतिदीप्ति वृद्धि की कमी से ACH के micropipette नगण्य रिसाव को इंगित करता है. 100 NA उत्तेजना तीव्रता (चित्रा 3, कथा) करने के लिए प्रतिक्रिया की कमी दिखाता है कि उत्तेजना के एक दहलीज तीव्रता endothelial सेल कैल्शियम को बढ़ाने के लिए आवश्यक है. इन तकनीकों को आसानी से अन्य vasoactive एजेंटों और ऊतक तैयारी के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
व्यावहारिक विचार: microiontophoresis के साथ काम करने के लिए arteriolar जेट अध्ययन में, कई बातें मान्यता प्राप्त होना चाहिए. हालांकि यह मुश्किल साबित हो गया दिया agonist के वास्तविक एकाग्रता का निर्धारण, उत्तेजना - प्रतिक्रिया घटता के भीतर और तैयारी के बीच प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं. ये स्पंद अवधि लगातार पकड़ (जैसे, 500 एमएस) और इंजेक्शन वर्तमान अलग (चित्रा 3 उदाहरण के लिए, 250, 500 और 1000) द्वारा किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, वर्तमान इंजेक्शन लगातार आयोजित किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, 500 NA) और स्पंद अवधि विविध (उदाहरण के लिए, 250, 500 और 1000 एमएस). एक परिभाषित agonist एकाग्रता की कार्रवाई करने के लिए एक संदर्भ के लिए, तैयारी उचित समाधान के साथ 5 superfused किया जा सकता है है. क्योंकि घुला हुआ पदार्थ इंजेक्शन के लिए ड्राइविंग बल बिजली के प्रभारी आंदोलन है, एजेंट को दिया जा शुद्ध micropipette से विस्थापित किया जा चार्ज करना चाहिए. सुनिश्चित करें कि ब्याज के एजेंट प्राथमिक प्रभारी वाहक है, यह उच्च एकाग्रता (जैसे, ACH के लिए एम 1) में भंग कर रहा है विद्युत असमस कम से कम. जब यह micropipette भरने समाधान के पीएच से छेड़छाड़ की आवश्यकता है, वाहन को नियंत्रित करने के लिए किसी भी nonspecific प्रभाव का पता लगाने के लिए आवश्यक हैं. उचित नियंत्रण भी वर्तमान के पारित होने के लिए किया जाना चाहिए अकेले (जैसे, isotonic नमक के साथ भरा micropipettes का उपयोग). रिहाई की अपनी साइट से एजेंट के प्रसार के लिए प्रभावी दूरी का पता लगाया हो सकता है और सबसे आसानी से एक शारीरिक प्रतिक्रिया (जैसे vasodilation, या ACH के इंजेक्शन पर intracellular कैल्शियम में वृद्धि) के लापता होने के द्वारा निर्धारित empirically रूप micropipette पर तैनात है चाहिए लक्ष्य साइट से दूरी को परिभाषित किया. अभ्यास में, प्रभावी प्रसार दूरी बहुत कैसे micropipette की नोक ऊतक में तैनात है द्वारा प्रभावित है, जैसे अगर ऊतक और अपनी टिप में नीचे दबाया टिप occluded है, की तुलना में इंजेक्शन बिगड़ा हुआ है. अत्यधिक संयोजी ऊतक विशेष रूप से परेशानी है और ऊतकों की सतह से शल्य चिकित्सा की तैयारी के दौरान हटा दिया जाना चाहिए. ध्यान भी नामित एजेंट के टिप घट की संभावना के लिए दी जानी चाहिए. यह अपेक्षाकृत कम दालों (उदाहरण के लिए, ≤ 1 ओं) का उपयोग करके कम से कम है. निरंतर धाराओं (उदाहरण के लिए, कई सेकंड) के साथ, agonist सिरे से निष्कासित कर दिया हो सकता है और अधिक तेजी से यह micropipette में थोक भरने के समाधान से प्रसार द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है है.
क्योंकि नगण्य मात्रा microiontophoresis के साथ विस्थापित है, अगर एक स्थानीय ईओण परिवेश बदलना (जैसे, एक depolarizing + K प्रोत्साहन देने) की कोशिश कर रहा है, यह प्रभावी ढंग से microiontophoresis साथ नहीं पूरा किया जा सकता है लेकिन थोक तरल पदार्थ के दबाव इंजेक्शन वांछित होने के साथ आसानी से हासिल रचना. एक arteriole के स्थानीय उत्तेजना के लिए, 2-3 सुक्ष्ममापी के आंतरिक diameters के साथ micropipette सुझावों इंजेक्शन दबाव 4-5 साई (28-35 kPa) और नाड़ी (जैसे, एक दूसरा) अवधि एक solenoid 10 वाल्व के साथ नियंत्रित के साथ अच्छी तरह से काम करते हैं. कहाँ microvessel पर एक micropipette से एक एजेंट के निरंतर वितरण की आवश्यकता है, दबाव इंजेक्शन उचित आंतरिक टिप व्यास (जैसे, ~ 10 सुक्ष्ममापी) 11,12 के micropipettes का उपयोग करने के लिए पसंद है. पानी निकलने की टोंटी वाल्व के साथ में जाना जाता है ऊंचाई की एक हीड्रास्टाटिक स्तंभ एक सस्ती प्रदान करता है, / लगातार दबाव सिर बंद अच्छी तरह से परिभाषित. फ्लो दर विंदुक टिप और दबाव ड्राइविंग के भीतरी व्यास द्वारा निर्धारित कर रहे हैं. हमेशा की तरह, वाहन नियंत्रण दबाव इंजेक्शन के nonspecific कार्रवाई को बाहर करने के लिए आवश्यक हैं.
Disclosures
सभी प्रक्रियाओं और जानवरों को शामिल प्रोटोकॉल पशु देखभाल और मिसौरी विश्वविद्यालय का प्रयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया और प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग के लिए संस्थान राष्ट्रीय स्वास्थ्य गाइड के साथ समझौते में प्रदर्शन इस लेख का उत्पादन स्टैनफोर्ड फोटोनिक्स द्वारा प्रायोजित किया गया था.
Acknowledgments
'लेखक की प्रयोगशाला में अनुसंधान स्वास्थ्य R37-HL041026 अनुदान, R01-HL086483 और R01-HL056786 (एसएसएस) और F32 HL097463 और T32 AR048523 संयुक्त राज्य अमेरिका के सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा से (पंजाब) के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Borosilicate Glass Capillary Tubes | Warner Instruments | GC120F-10 | |
| Horizontal Pipette Puller | Sutter Instrument Co. | model P-97 | |
| Acetylcholine Chloride | Sigma-Aldrich | A6625 | |
| adapter for Luer hub | Martech | AC1343 | To secure microcapillary tubing |
| 0.2 μm Nylon Titan filter | Sun Sri | 42204-NN | Low retention volume to minimize loss |
| 5 ml syringe | BD Biosciences | 309603 | |
| Pipette Holder | Warner Instruments | E45W-M12VH | |
| Silver Wire | Warner Instruments | AG10W | 0.25mm diameter |
| 3-axis micromanipulator | Siskiyou, Inc. | DT3-100, MXB, MXC, MGB/8 | Components for manipulator as shown |
| microiontophoresis current programmer | World Precision Instruments, Inc. | Model 260 | |
| trigger device | Custom | custom | circuit provided in Suppl. Figure 1 |
| stainless steel plate | McMaster-Carr | 1/8" X 12" X 12" | According to design |
| Intensified Digital Camera | Stanford Photonics Inc | XR/Mega-10 | Integrated with Piper Control software |
References
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