Summary
Microiontophoresis mikropipet içi ve dışı arasındaki elektriksel potansiyel bir fark yanıt mikropipet iyonların hareketi gerektirir. Biyolojik aktif molekülleri böylece elektrik akımı ile orantılı olarak teslim edilir. Biz mikrosirkülasyon endotel bağımlı vazodilatasyon çalışma mikromanipülasyon ile birlikte asetilkolin microiontophoresis göstermektedir.
Abstract
Microiontophoresis deneysel bir hazırlık içinde belirli bir yerinde bir çözünen teslim mikropipet ucu üzerinden akım geçişi gerektirir. Microiontophoresis tekrarlanabilir nöronlar 2 üzerine nörotransmitter ve nöropeptitlerin sunarak sinaptik iletim 1 taklit edebilirsiniz. İhmal edilebilir hacmi (sıvı) deplasman deneysel hazırlanması mekanik bozukluğu ortadan kaldırır. 3 mikrosirkülasyon bu tekniklerin uyarlanması vazodilatasyon ve vazokonstrüksiyon mekanizmaları in vivo 4,5 mikroskobik düzeyde incelenmesi gereken sağladı. Gibi lokalize teslim sistemik kan basıncı ve doku kan akımı ya da dönüşlü değişiklikler, böylece mikrodamarlar içsel özelliklerini ifşa çağrıştıran olmadan mikrovasküler bir ağ içinde tanımlanmış siteler okudu vazomotor yanıtları önemli bir avantaj sağlıyor.
Microiontophoresis bir sınırlaması ilgi site teslim ajan konsantrasyonu tam olarak tespit 6 zor olmasıdır. Bununla birlikte, mikropipet ucu serbest ejeksiyon akım şiddeti ve süresi 2,7 orantılıdır gibi tekrarlanabilir uyaran-tepki ilişkileri kolayca tanımlanan deneysel koşullar altında (aşağıda açıklanmıştır) tespit edilebilir. Microiontophoretic teslim etkileyen Ek faktörler çözünen konsantrasyon ve çözelti içinde iyonizasyon içerir. Mikropipet ucunun iç çapı istinat akımı ile dengelendi olabilir difüzyonal 'kaçak', en aza indirmek için ~ 1 mm veya daha az olmalıdır. Böylece dışa akım (pozitif) bir katyon ve mikropipet içinde tutmak için kullanılan bir negatif akım çıkarmak için kullanılır.
Mikropipetler Fabrikasyon sofistike elektronik Elcikler 8 ile kolaylaştırılır. Mikropipetler bir filament içeren cam kapiller tüplerin çekti mikropipet ucu içine 'fitilleri' çözüm arka uç ("yeniden toprakla") dolu. Bu ilgi ve çözüm çıkartma çözüm mikropipet lümenine içeren bir şırıngaya bağlı bir microcapillary tüp ekleyerek yapılır. Mikromanipülatörler deneysel bir hazırlık içinde mikropipetler istenen yerleştirme sağlar. Hareketli bir taban üzerine monte mikromanipülatörler mikrovasküler ağları (aşağıda geliştirilen) topografya göre hazırlık etrafında yerleştirilmiş olabilir.
- İşbu protokol microiontophoresis asetilkolin (ACh + Cl): fare Cremaster'ın kas hazırlık endotel bağımlı vazodilatasyon üretmek için bir arteriyol (Jüpiter ID # 2874 ilişkili protokol) üzerine göstermektedir. Stimulus teslimat elektronik bir tetikleyici ile dijital görüntü elde etme ile senkronize edilir. Cx40 BAC-GCaMP2 transgenik farelerin 9 kullanımı yaşayan mikrosirkülasyon arterioler endotel hücreleri vazodilatasyon altında yatan hücre içi kalsiyum yanıtları görselleştirme sağlar.
Protocol
1. Hayvan Bakımı ve Kullanımı
Inceleme ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu onayını takiben, en az 12 hafta eski erkek fareler kullanılır. Bir fare pentobarbital intraperitoneal (ip) enjeksiyonu ile sodyum (60 mg / kg) ile anestezi. Cerrahi işlemler ve deneysel protokolleri boyunca, anestezi gibi gerekli takviyeleri (% 10-20, ilk enjeksiyon ip) (parmak veya kuyruk tutam çekilme yanıt belirtilen her 30-60 dakika) tarafından korunur. Deneysel işlemin tamamlanmasından sonra fare pentobarbital (ip) ve servikal dislokasyon tarafından ötenazi ile aşırı doz.
2. Mikropipetler ve Microiontophoresis
- Microiontophoresis mikropipetler (iç ucu çapı, yaklaşık 1 mikron) borosilikat camdan kılcal tüpler yatay bir pipet çektirmenin kullanarak hazırlanmıştır. Bizimki bir sertlik ~ 5 mm konik; uzun tapers daha esnektir.
- Mikropipetler M 18.2 suda çözünmüş 1M ACh (Figure1A-C) ile yeniden toprakla. Asfaltlanması için, microcapillary tüp ilgi agonist (Şekil 1) içeren bir şırınga birleştiğinde 0.2 mikron filtre bağlıdır. Bunlar hazır fabrikasyon (aşağıda) ya da ticari firmaların satın olabilir. Microcapillary tüp microcapillary tüp geri çekilirken mikropipet doldurur gibi mikropipet ve ACh çözüm lümenine teslim arka sonuna eklenir. Ucu aşağı dönük mikropipet Holding, hava kabarcıkları, yavaşça mikropipet Flicking kaldırılır.
- Mikropipet mikromanipülatör (Şekil 2) monte tutucu güvence altına alınmıştır. Tutucu bir microiontophoresis programcı da pozitif terminaline bağlı harici bir pin, mikropipet içinde ACh çözüm bağlayan bir gümüş tel vardır. Doku hazırlanması kenarında güvenli ikinci bir gümüş tel mikropipet ucu hazırlığı içinde serum fizyolojik solüsyon içine gelişmiş olarak devreyi tamamlamak için negatif terminaline bağlı.
- Mikropipet ucu arterioler duvara bitişik konumlandırılmış (ya da floresan yanıt) vazodilatasyon önlemek için istinat akımı uygulanır. Mevcut İstinat mikropipet ucu (iç çapı = 1 mm) ve agonist konsantrasyonu boyutuna göre değişir, ancak yüksek tanımlı parametreler (1M ACh, 1 mikron ucu için ~ 200 nA) tekrarlanabilir. Istinat akımı görüntü elde başlangıcı ile senkronize elektronik tetik (Ek Şekil 1) ile mevcut ejeksiyon teslim tesadüf olmaktan çıkar.
3. Mikromanipülasyon
- XY mikroskop sahne için özel bir platform ferromanyetik paslanmaz çelik üretildi. Platform ölçüleri (1 / 8 "X 12" X 13 ") manyetik üsleri (Şekil 2B) hazırlık tarafından dikte konumlandırma etkinleştirmek için güvenli istenilen (Şekil 2A). Mikromanipülatörler deneysel olarak hazırlık etrafında pozisyon mikromanipülatörler için yeterli alan sağlar. Bunlar; ilgi (Şekil 2C) siteleri konumlandırma mikropipetler için hazırlık etrafında fabrikasyon platform üzerine yerleştirilir.
4. Temsilcisi Sonuçlar
- Mikropipet ucu bir arteriyol bitişik konumlandırılmış ile ACh için floresan yanıt (ACh kaçağını önlemek için ayarlanabilir daha mevcut istinat) vardır. Bir eşik uyaran altında hiçbir etkisi vardı. Ancak, uyaran şiddeti arttıkça, endotelyal hücre kalsiyum floresan, arteriyol boyunca giderek daha büyük mesafeler üzerinde arttıkça stimülasyon site (Şekil 3) floresan yoğunluğu yoktu.
Şekil 1. Microiontophoresis Pipetler Dolgu Yöntemi. A) microcapillary tüp (yeşil ok) B) microcapillary tüp içine beslenir, daha sonra 1M ACh ile dolu bir şırınga bağlı filtre 0.2 mikron (mor ok) bağlı bir sıkıştırma uydurma (mavi ok ) sabitlenir arka uç ve çözüm yoluyla microiontophoresis pipet pipet doldurulduktan sonra, aşağı ucu tutun). C mikropipet lümen doldurmak için yerinden hafifçe konik üzerinde kabarcıklar (siyah ok) kaldırmak için fiske.
Şekil 2. Mikromanipülatör Yerleştirme için özel Platformu. Deneysel hazırlık etrafında yerleştirilmiş A) ferromanyetik paslanmaz çelik platform XY translasyonel sahne içeren bir özel MVX10 mikroskop taban üzerine yerleştirilmiştir B) Dairesel manyetik üsleri kompakt 3-eksenli mikromanipülatörler altına yapıştırılmış C) mikromanipülatörler (Bkz. ilişkili protokol: vallahi ID # 2874) ilgi belirli siteleri çalışma.ir kompakt boyutu ve çok yönlülük, aynı anda birden fazla mikropipetler kullanılacak sağlar.
Şekil 3. Arteriollerde Kalsiyum Floresan arterioler duvarını kaplayan endotel hücreleri kalsiyum floresan uyaran yoğunluğu arttı. Ilk 3 panelleri görüntüleri) A) 250 nA, B floresan yanıtları 500 nA ve C) 1000 nA ejeksiyon (500 ms darbe süresi). Endotel hücre kalsiyum floresan üzerinde artan mesafe, AC (sırasıyla ~ 130, 270 ve 400 mm,) parantez ile gösterilir. Her bir panel arteriyol boyunca referans çizgisi için floresan tepkiler ACh (F / Fo) stimülasyon site kaydedildi gösterir. D) F / Fo vs zaman artan ACh uyaranlara için Kayıtlar. Mevcut ejeksiyon arttıkça, F / Fo genlik ve süresi arttı. 100 nA uyaran eşik değerinin altında olduğunu ve hiçbir etkisi olmadığını unutmayın.
Ek Şekil 1. Elektronik tetik için devre şeması Bu devre bir kişisel bilgisayara bir paralel port arabirim. 5V sabit bir TTL darbe sağlar aktive. 7805 çip 9-12V DC güç kaynağı (pil uygun gerilim ince) bağlı bir 5V voltaj regülatörü. 7805, çıkış Dört İkili Switch ve devrenin çıkış gücü sağlar. 1K direnç karşısında Giriş bilgisayardan.
Discussion
Burada açıklanan protokol microiontophoresis için mikropipetler hazırlanması ve uygulanması için yöntemler göstermektedir. Asetilkolin Teslimat anestezi fare arteriollerde kalsiyum sinyalizasyon altta yatan endotel bağımlı vazodilatasyon göstermek için kullanılır. Çalışmamızın sonuçları göstermektedir ki ACh microiontophoresis mikropipet (Şekil 3) güncel ejeksiyon yoğunluğu ile endotel hücre kalsiyum floresan artar artar üzerinde mesafe. Dinlenme koşullar altında floresan artış eksikliği mikropipet ACh önemsiz kaçak gösterir. 100 nA uyaran yoğunluğu (Şekil 3, efsane) yanıt eksikliği stimülasyon bir eşik yoğunluğunu artırmak için endotel hücre kalsiyum için gerekli olduğunu göstermektedir. Bu teknikleri diğer vazoaktif ajanlar ve doku hazırlıkları kolayca adapte edilebilir.
Pratik Düşünceler: microiontophoresis arterioler reaktivite çalışma ile çalışan, bazı şeyleri kabul edilmelidir. Teslim agonist gerçek konsantrasyonunu belirlemek zor olsa da, uyaran-yanıt eğrileri hazırlıkları içinde ve arasında tekrarlanabilir. Bu darbe süresi sabit tutarak (örneğin, 500 ms) ve ejeksiyon akımı (Şekil 3 örneğin, 250, 500 ve 1000 nA) değişen yapılabilir. Alternatif olarak, mevcut ejeksiyon sabit tutulur olabilir (örneğin, 500 nA) ve darbe süresi değişken (örneğin, 250, 500 ve 1000 ms). Tanımlanmış bir agonist konsantrasyonu eylemleri için bir başvuru için, hazırlama, uygun bir çözüm 5 ile superfused olabilir . Çözünen ejeksiyon için itici güç elektrik yükü hareketi olduğundan, teslim edilecek ajan mikropipet yerinden net ücret taşımalıdır. Ilgi ajan birincil sorumlu taşıyıcısı olduğundan emin olmak için, elektro-osmoz en aza indirmek için yüksek konsantrasyon (örneğin, ACh için 1 M) çözülür. Mikropipet dolum çözüm pH manipüle gerektirdiğinde, araç kontrolleri, herhangi bir non-spesifik etkilerini tespit etmek için gereklidir. Uygun kontrolleri de yalnız akım geçişi için yapılmalıdır (örneğin, izotonik tuzlu su ile dolu mikropipetler kullanarak). Sürümü kendi sitesinden ajan yayılması için etkili mesafe tespit olmalı ve en kolay mikropipet konumlandırılmış fizyolojik bir tepki ortadan kalkması (örneğin, vazodilatasyon veya hücre içi kalsiyum ACh ejeksiyon üzerine bir artış) tarafından deneysel olarak belirlenir. hedef site mesafeler tanımlanmıştır. Pratikte, etkin difüzyon mesafesi önemli ölçüde mikropipet ucu doku yerleştirilmiş nasıl etkilenir; doku ve ucu içine basılı ucu tıkalı ise, örneğin, ejeksiyon engelli daha. Aşırı bağ dokusu oldukça zahmetli ve cerrahi hazırlanması sırasında doku yüzeyinin uzaklaştırılması gerekir. Dikkat ajan ucu tüketen olasılığı da verilmelidir. Bu nispeten kısa bakliyat (örneğin, ≤ 1 ler) kullanılarak en aza indirilmiştir. Sürekli akımlar (örneğin, birkaç saniye) ile agonist mikropipet dökme dolum çözüm difüzyon ile değiştirilmesi daha ucundan daha hızlı bir şekilde sınır dışı olabilir.
Biri (örneğin, + uyaran bir depolarizan K sağlamak için) yerel iyonik ortam değiştirmek için çalışıyoruz. Halinde önemsiz hacmi, microiontophoresis ile yerinden. Çünkü, bu etkili bir şekilde microiontophoresis ile başarılı değil. Fakat kolayca istenilen dökme sıvı basıncı ejeksiyon ile sağlanır. bileşimi. Bir arteriyol yerel uyarılması için, iç çapları 2-3 mikron ile mikropipet ipuçları ejeksiyon basıncını 4-5 psi (28-35 kPa) ve bir solenoid valf 10 ile kontrol darbe süresi (örneğin, 1 saniye) ile iyi çalışır. Bir mikrodamar üzerine bir mikropipet bir ajan sürekli teslim gerekli olduğu durumlarda, basınç ejeksiyon uygun iç uç çapı (örneğin, ~ 10 mikron) 11,12 mikropipetler kullanılması tercih edilir. Açık / kapalı sabit basınç kafası iyi tanımlanmış bir stopcock vana ile bilinen bir yüksekliğe bir hidrostatik sütun, ucuz bir sağlar. Akış hızları, pipet ve sürüş basınç iç çapı ile belirlenir. Her zaman olduğu gibi, araç kontrolleri basınç ejeksiyon nonspesifik eylemler dışlamak için gereklidir.
Disclosures
Missouri Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmış ve hayvanları da içeren tüm prosedürleri ve protokolleri için National Institutes Sağlık Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu ile uyum içinde yapılan edildi. Üretimi Bu makalede, Stanford Fotonik sponsor oldu .
Acknowledgments
Yazarların laboratuar araştırmalar, Ulusal Sağlık hibe R37-HL041026, R01-HL086483 ve R01-HL056786 (SSS) ve Amerika Birleşik Devletleri Halk Sağlığı Servisi F32-HL097463 ve T32-AR048523 (PB) Enstitüleri tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Borosilicate Glass Capillary Tubes | Warner Instruments | GC120F-10 | |
| Horizontal Pipette Puller | Sutter Instrument Co. | model P-97 | |
| Acetylcholine Chloride | Sigma-Aldrich | A6625 | |
| adapter for Luer hub | Martech | AC1343 | To secure microcapillary tubing |
| 0.2 μm Nylon Titan filter | Sun Sri | 42204-NN | Low retention volume to minimize loss |
| 5 ml syringe | BD Biosciences | 309603 | |
| Pipette Holder | Warner Instruments | E45W-M12VH | |
| Silver Wire | Warner Instruments | AG10W | 0.25mm diameter |
| 3-axis micromanipulator | Siskiyou, Inc. | DT3-100, MXB, MXC, MGB/8 | Components for manipulator as shown |
| microiontophoresis current programmer | World Precision Instruments, Inc. | Model 260 | |
| trigger device | Custom | custom | circuit provided in Suppl. Figure 1 |
| stainless steel plate | McMaster-Carr | 1/8" X 12" X 12" | According to design |
| Intensified Digital Camera | Stanford Photonics Inc | XR/Mega-10 | Integrated with Piper Control software |
References
- Majno, G., Palade, G. E. Studies on inflammation. 1. The effect of histamine and serotonin on vascular permeability: an electron microscopic study. J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 571-605 (1961).
- Majno, G., Palade, G. E., Schoefl, G. I. Studies on inflammation. II. The site of action of histamine and serotonin along the vascular tree: a topographic study. J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 607-626 (1961).
- Grant, R. T. Direct Observation of Skeletal Muscle Blood Vessels (Rat Cremaster). J. Physiol. 172, 123-137 (1964).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).
- Bohlen, H. G., Gore, R. W., Hutchins, P. M. Comparison of microvascular pressures in normal and spontaneously hypertensive rats. Microvasc. Res. 13, 125-130 (1977).
- Klitzman, B., Duling, B. R. Microvascular hematocrit and red cell flow in resting and contracting striated muscle. Am. J. Physiol. 237, 481-490 (1979).
- Hungerford, J. E., Sessa, W. C., &, S. egal, S, S. Vasomotor control in arterioles of the mouse cremaster muscle. FASEB J. 14, 197-207 (2000).
- Figueroa, X. F., Paul, D. L., Simon, A. M., Goodenough, D. A., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. Central role of connexin40 in the propagation of electrically activated vasodilation in mouse cremasteric arterioles in vivo. Circ. Res. 92, 793-800 (2003).
- Wolfle, S. E., Schmidt, V. J., Hoepfl, B., Gebert, A., Alcolea, S., Gros, D., de Wit, C. Connexin45 cannot replace the function of connexin40 in conducting endothelium-dependent dilations along arterioles. Circ. Res. 101, 292-1299 (2007).
- Milkau, M., Kohler, R., de Wit, C. Crucial importance of the endothelial K+ channel SK3 and connexin40 in arteriolar dilations during skeletal muscle contraction. FASEB J. 24, 3572-3579 (2010).
- Bagher, P., Duan, D., Segal, S. S. Evidence for impaired neurovascular transmission in a murine model of Duchenne Muscular Dystrophy. J. Appl. Physiol. 110, 601-610 (2011).
- Tallini, Y. N., Brekke, J. F., Shui, B., Doran, R., Hwang, S. M., Nakai, J., Salama, G., Segal, S. S., Kotlikoff, M. I. Propagated endothelial Ca2+ waves and arteriolar dilation in vivo: measurements in Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice. Circ. Res. 101, 1300-1309 (2007).
- Grant, R. T. The effects of denervation on skeletal muscle blood vessels (rat cremaster). J. Anat. 100, 305-316 (1966).
- Proctor, K. G., Busija, D. W. Relationships among arteriolar, regional, and whole organ blood flow in cremaster muscle. Am. J. Physiol. 249, H34-H41 (1985).
- Bagher, P., Segal, S. S. Regulation of blood flow in the microcirculation: Role of conducted vasodilation. Acta Physiol. , (2011).
- Hill, M. A., Simpson, B. E., Meininger, G. A. Altered cremaster muscle hemodynamics due to disruption of the deferential feed vessels. Microvasc. Res. 39, 349-363 (1990).
