Ett optimerat protokoll för uppfödning Fopius arisanus Flugor ett parasitod av Tephritid frukt

Summary

Fopius arisanus är en ägg-larver parasitod av Tephritid fruktflugor som framgångsrikt används vid biologisk bekämpning av dessa viktiga tropiska skadedjur. Vi beskriver här ett optimerat protokoll för uppfödning F. arisanus i liten skala med hjälp av lättillgängliga material.

Abstract

Fopius arisanus (Sonan) är en viktig parasitod av Tephritid fruktflugor i minst två skäl. Först är det en av endast tre opiine parasitoider kända för att infektera värden under ägg-stadiet ^1. För det andra har det ett brett spektrum av potentiella värdar bananflugan. Kanske på grund av sin livshistoria, F. arisanus har varit ett framgångsrikt används för biologisk bekämpning av fruktflugor i flera tropiska områden ^2-4. Ett hinder för den breda användningen av F. arisanus för bananflugan kontroll är att det är svårt att etablera en stabil laboratorium koloni ^5-9. Trots denna svårighet, på 1990-talet USDA forskare utvecklat en tillförlitlig metod för att upprätthålla laboratorium populationer av F. arisanus ^10-12. Det finns stort intresse i F. arisanus biologi ^13,14, särskilt vad gäller dess förmåga att kolonisera en mängd olika Tephritid värdar ^14-17, intresset är särskilt driven av den alarmerande spridningen av Bactrocera bananfluga skadedjur till nya kontinenter under det senaste decenniet ^18. Ytterligare forskning om F. arisanus och ytterligare utbyggnad av denna art som en biologisk bekämpning agent kommer att gynnas av optimeringar och förbättringar av uppfödningsmetoder. I detta protokoll och tillhörande video artikeln beskriver vi en optimerad metod för uppfödning F. arisanus baserad på en tidigare beskrivna tillvägagångssätt ^12. Den metod vi beskriver här tillåter uppfödning av F. arisanus i liten skala utan att använda frukten, med material som finns i tropiska regioner runt om i världen och med relativt låga kroppsarbete krav.

Protocol

1. Förbered värd ägg bananfluga för parasitization

1. Förbered ett substrat för ägg bananfluga som parasiterade genom att förbereda agar (alternativt Gelcarin GP812, FMC Biopolymer, Ewing NJ, ett mer kostnadseffektivt alternativ) fylls rätter, 10 cm i längd per sida och 1,5 cm djup. Förbered agar vid en koncentration av 9 g per liter vatten.
2. Fyll rätter till kanten med flytande agar (ca 70ml), och låt dem svalna och stelna (minst 45 minuter).
3. När agar blocken är solida, tillämpa ett enda lager av silkespapper (en enda skikt av Georgia Pacific "preferens" parti vävnad), täcker det bästa av varje block. Vävnaden ska hålla enkelt på agar grund av ytfukt.
4. Applicera en 0,5 ml volym ägg bananfluga slammas upp i vatten till vävnaden täcks ytan av agar block. I vår insectary, motsvarar detta ca 6000 ägg av Bactrocera dorsalis (12000 ägg per ml).
5. Använd en ren 2,5 cm bred pensel doppad i vatten för att sprida äggen bananfluga jämnt över vävnaden ytan.
6. Placera äggen bananfluga under botten skärmen på parasitod burar så att äggläggning. Knacka på undersidan av nedre skärmen för att avlägsna döda parasiter som kan hindra ägg. Det bästa är om den nedre skärmen inte röra äggen.
7. Låt parasiter till oviposit natten och in på nästa dag, ca 21 timmar. Det är tillräcklig tid för en stor andel av de ägg som skall parasiterade. Längre exponering risker superparasitization.

2. Kläckning och pupation av parasiterade värd fruktflugor

1. Förbered uppfödning container genom att placera 3 till 3,5 förberedda agar block av parasiterade ägg per 1,25 liter bananfluga kost ¹⁹ med ägg uppåt.
2. Placera kosten behållaren med ägg på en stock över ett 1,5 cm djupt lager av fin kvalitet vermikulit eller tvättad sand i ett större pupation behållare. Täck pupation behållare med lock och tejpa kanterna med maskeringstejp. Vermikulit kan återanvändas efter siktning (se nedan).
3. Kontrollera att det finns tillräckligt med utrymme mellan toppen av kost behållaren och pupation behållaren lock för frukt fluglarver att krypa ut och "pop" ²⁰ i vemiculite nedan.
4. Flytta pupation behållare till ett rum på 27 ° C och 80% relativ fuktighet (RF) i en vecka. Täck behållarna med en mörk duk för de första fyra dagar bort då trasan för resterande dagar.
5. Ta bort larver kosten efter en vecka, har en gång larver dök och kom in i vermikulit för pupation. Om det finns larver i vermikulit, tillåta dem att förpuppas över natten.
6. Sila puppor från vermikulit. Börja med ett grovt såll (ca 3 mm) och använd sedan en hand sil att undanröja eventuella återstående klumpar av vermikulit.

3. Sortering och urval

1. Puppa som innehåller F. arisanus kan delvis åtskilda från unparasitized bananflugor efter storlek. Samla puppa mellan 1,65 och 2,26 mm i diameter, eftersom dessa kommer att berikas för parasiterade flugor. ¹² Puparia som är mindre innehåller mestadels underdimensionerade parasiter större puppa innehåller mestadels flugor. Observera också att för de parasiterade puppor andelen honor korrelerar positivt med storlek ^12.
2. En rad olika metoder kan användas för att sortera puppor efter storlek. Vi kommer att beskriva en mekanisk metod att använda en anpassad storlek sorterare ^21.
3. Placera puppor i tratten på toppen av en vibration feeder som sakta matar storleken sorterare.
4. Mata puppor i storlek sorterare, som består av ett par något avvikande rullande barer i 30 graders vinkel. Den puppor droppe individuellt av storleken på en rad platser som tomma i tio separata behållare genom en tratt.
5. Samla puppor från koppar i storleksordningen 1,65 till 2,26 mm och placera dem i ett framväxten bur i 7 dagar tills det mesta flugor har framkommit under unparasitized puppor.
6. Sedan använder en fläkt för att separera tomma puparia från de som fortfarande innehåller insekter.

4. F. arisanus uppkomst och underhåll

1. För att behålla kolonin F. arisanus använda en parasitod hålla bur med en avtagbar glasfront, ca 25 cm i längd per sida. Buren har 1mm ² screening på toppen och två av sidorna. På baksidan av buren är täckt av en gummiduk med en 9 cm hål för åtkomst. I botten på buren har en utskuren täckt på insidan med 1-2mm ^{2 för} stora nog att tillåta placering av två agar block med ägg bananfluga för parasitod äggläggning.
2. Innehavet burarna bör också ha en färgad del längs botten fjärdedel av glaset fronten för att minimera ljus som kan skapa parasitod trängs längs framsidan av buren, vilket resulterar i förhöjd dödlighet.
3. Placera ca 11 g av dessa urvalTed puppor i plastbehållare cirka 9 cm i diameter. Detta borde innebära ca 600-700 parasiter per bur. Storlek val bör resultera i cirka 60% kvinnor.
4. Fäst skärmade locken till behållarna. Locken bör täckas med 2 mm ² screening, som gör att vuxna F. arsianus att lämna behållare när de uppstår, men kommer att innehålla alla återstående fruktflugor.
5. Bibehåll parasiter vid 24 ° C och ca 45% RH med en 12:12 fotoperiod och god ventilation. Om hög dödlighet observeras kan flytta burar utomhus i ett par timmar per dag eller öka ventilationen minska den. Parasiter ska vara redo att oviposit i ytterligare en vecka och ska vara produktiva för ytterligare två veckor.
6. Streak outspädd spunnet honung längst upp i burar minst tre gånger per vecka eller när de tillgängliga honungen är torr. Applicera snurrade honungen i smala strimmor med hjälp av en fingertopp. Observera att om ränder är för tunga honungen kommer att droppa in i buren, om för ljus honung torkar ut snabbt och kräver ofta förnyad ansökan.
7. Placera agar block (10 cm x 10 cm x 4 cm) på toppar i burar för att ge fukt till parasiter. Dessa bör bytas två gånger i veckan.

5. Representativa resultat:

Vi rapporterar här resultat från kvalitetskontroll genomföras på USDA-ARS F. arisanus uppfödning drift i Hilo, Hawaii mellan januari 5 och 22 juni 2010. Uppfödning i Hilo plats på skalan som beskrivs i den här videon artikel och protokoll inleddes i augusti 2009 och inledande problem och justeringar med den nya platsen hade varit mest beslutas av januari. Därför är dessa data är representativa för de resultat som andra forskare skulle få starta sin koloni om de följer det protokoll som beskrivs och har insekter erfarenhet uppfödning i allmänhet. Under denna period var vi behålla en liten koloni av F. arisanus: 4 parasitod hålla burar som produceras per vecka, vilket motsvarar ungefär 3600 F. arisanus.

En inledande kontroll av anrikat parasitization satser utfördes genom att ta en 2 g prov av puppor i storleksordningen 1,65 till 2,26 mm (berikat) innan ytterligare en vecka av utveckling i en anläggning bur (dvs. omedelbart efter larver diet togs bort och puppor siktat och storlek sortering. Vi hänvisar till dessa som "tidiga puppor). Under de första tre månaderna 2010 den genomsnittliga andelen parasiter i det anrikade prov var 0,46 (SD = 0,18). Under de följande kvartalet i medelvärdet var 0,58 (SD = 0,08), vilket speglar stabiliseringen av kolonin och uppfödning förfaranden på den nya platsen. Observera att berikas puppor som inte var framgångsrikt parasiterade omfatta dem som inte producerar emergents och de som produceras flugor.

Efter ytterligare en vecka i innehavet bur bort tomma puparia ytterligare två grams prov togs ("sen puppor). Bananflugor representerade under 1% av detta andra prov. Den låga andelen av fruktflugor beror delvis på den tidigare uppkomsten av flugor jämfört med parasiter, så de flesta flugor kvar i innehavet behållaren.

Slutligen ger figur 1 avkastningen i PUPP-massa från januari till juni 2010. Avkastningen mäts från puppor anrikas i storlekarna av intresse, 1,65-2,26 mm. Den stora massan av "tidiga puppor" i början av året indikerar en hög andel av bananflugor och unemerged puppor på den tiden, samtidigt som justeringar görs för att den nya anläggningen.

Figur 1. Avkastning av anrikat (PUPP-diametern 1,65-2.26mm) tidigt (direkt efter storlek urval) och "sent" (efter att ha hållit i en vecka och ta bort tomma höljen) puppor vid ARS-USDA F. ariasnus koloni i Hilo, Hawaii , januari - juni 2010

Discussion

I detta protokoll och tillhörande video artikeln har vi beskrivit och visat ett optimerat protokoll för uppfödning F. ariasnus, en parasitod av Tephritid bananflugor, i laboratoriemiljö. Detta protokoll har förfinats genom åren för att minimera den mängd arbete och specialiserad utrustning som behövs för att upprätthålla en koloni. Vi noterar att en väletablerad, produktiv och stabil koloni av flugor värd frukt krävs för varje försök till uppfödning parasiter. I vår insectary använder vi Bactrocera dorsalis som värd bananfluga, men andra arter har visat sig vara behörig värdar samt ^14-17.

Flera aspekter av F. arisanus koloni underhåll återstår att utforskas. Dessa omfatta storleken på laboratoriet anpassning i denna art ^10, mekanismer för inlärning ²² och genetiska förändringar som kan uppstå med anpassning och mekanismer som kan vara inblandade i värd bananflugan plasticitet.

Under de senaste tio åren har det funnits flera exempel på spridning av Dacine flugor i hela världen, särskilt de i släktet Bactrocera: B. dorsalis i Franska Polynesien, B. carambolae i delar av Sydamerika, B. invadens i Afrika och B. zonata i Afrika och norra Medelhavet. ^3,23,18 Testa hur effektiva biologiska bekämpningsmedel som F. arisanus mot andra Bactrocera arter bör ha hög prioritet, och det är vår förhoppning att tillämpningen av de metoder som beskrivs i detta protokoll och tillhörande video artikeln kommer att accelerera forskningen på F. arisanus i ett större antal platser ^24. Slutligen kan ytterligare forskning med denna metod som utgångspunkt ger också viktig information till koloniseringen av nya ägg parasitoider ^25,1