Summary
Vi beskriver en låg kostnad, hög genomströmning metod för att screena för svamp endoglucanase aktivitet i
Abstract
Cellulas enzymer (endoglucanases, cellobiohydrolases och β-glucosidases) hydrolysera cellulosa till komponent socker, vilket i sin tur kan omvandlas till drivmedel alkoholer 1. Potentialen för enzymatisk hydrolys av cellulosa biomassa för att ge förnybar energi har intensifierat arbetet med att ingenjör cellulaser för ekonomisk bränsleproduktion 2. Av särskilt intresse är svamp cellulaser 3-8, som redan används industriellt för livsmedel och textilier bearbetning.
Identifiera aktiva varianter bland ett bibliotek av mutant cellulaser är kritisk till den tekniska processen, aktiva mutanter kan testas ytterligare för förbättrade egenskaper och / eller utsatts för ytterligare mutagenes. Effektiv konstruktion av svamp cellulaser har försvårats av bristen på genetisk verktyg för infödda organismer och av svårigheter att uttrycka enzymer i heterologa värdar. Nyligen utvecklade Morikawa och medarbetare en metod för att uttrycka i E. coli den katalytiska domäner endoglucanases från H. jecorina 3,9, en viktig industriell svamp med kapacitet att utsöndra cellulaser i stora mängder. Funktionell E. coli uttryck har också rapporterats för cellulaser från andra svampar, inklusive Macrophomina phaseolina 10 och Phanerochaete chrysosporium 11-12.
Vi presenterar en metod för hög throughput screening av svamp endoglucanase aktivitet i E. coli. (Fig 1) Den här metoden använder den gemensamma mikrobiella färgen Congo Red (CR) för att visualisera enzymatisk nedbrytning av karboximetylcellulosa (CMC) av celler som växer på fast substrat. Verksamheten analysen kräver billig reagenser, minimal manipulation, och ger entydiga resultat som zoner av nedbrytning ("glorior") på kolonin platsen. Även ett kvantitativt mått på enzymatiska aktiviteten inte kan fastställas genom denna metod, har vi funnit att halo storlek korrelerar med total enzymatisk aktivitet i cellen. Ytterligare karakterisering av enskilda positiva kloner kommer att avgöra, relativ protein fitness.
Traditionella bakteriell helcells CMC / CR aktivitet analyser 13 innebär att hälla agar innehåller CMC på kolonier, som är föremål för korskontaminering eller inkubera kulturer i CMC agar brunnar, vilket är mindre mottaglig för storskaliga experiment. Här rapporterar vi ett förbättrat protokoll som ändrar befintliga tvätta metoder 14 för cellulas aktivitet: celler odlas på CMC agarplattor tas bort före CR färgning. Vår protokoll minskar betydligt korskontaminering och är mycket skalbar, vilket gör att snabb screening av tusentals kloner. Förutom H. jecorina enzymer har vi uttryckt och avskärmade endoglucanase varianter från Thermoascus aurantiacus och Penicillium decumbens (visas i figur 2), vilket tyder på att detta protokoll tillämpas på enzymer från en rad olika organismer.
Protocol
1. Screening tallrik förberedelse
- Lägg 25g medelstora LB tillväxt, 15g agar och 1.5g karboximetylcellulosa (CMC) substrat till 1L destillerat vatten och autoklav för att sterilisera.
- Efter autoklavering, låt medelstora svalna och tillsätt lämplig antibiotika och IPTG till en slutlig koncentration av 100μM.
- Häll 200ml medelstora varje i 5 stora torget petriskålar / brickor bioassay (240 x 240 x 20 mm eller större). Låt plattorna torka helt.
2. Endoglucanase bibliotek generation och skärm
- Skapa ett bibliotek av endoglucanase katalytisk domän (er). Detta kan göras på många sätt (t.ex. platsspecifika riktad eller slumpmässig mutagenes, rekombination, etc.) och bestäms av forskaren.
- Klon biblioteket till en vektor så att de står under kontroll av T7 promotorn med lac operatör, och innehåller en pelB signalsekvensen för inriktning till periplasm. Ett exempel på en lämplig vektor är pET22b (+) från Novagen.
- Omvandla den endoglucanase biblioteket till E. coli stam BL21 (DE3) och platta för enstaka kolonier.
- Inkubera förvandling över natten vid 37 ° C.
- Använda steril tandpetare, inokulera kloner i 96 och djupa brunnar plattor innehåller 400μL LB mediet kompletteras med lämplig antibiotika. Inkubera vid 37 ° C över natten med skakning på 250 rpm.
- Lägg steril glycerol till 96 väl över natten kulturer till en slutlig koncentration på 10% för långtidsförvaring vid -80 ° C. Detta kommer att vara herre plattan.
- Med hjälp av en 96-stifts stämpeln replikera tallrik natten kulturer på screening plattorna innehåller IPTG och CMC. Upp till 5 uppsättningar natten kulturer kan stämplas på varje screening tallrik.
- Märk screening plattorna så att identiteten och orientering för varje 96 brunnar är känd.
- Inkubera de stämplade biblioteken i rumstemperatur (17-25 ° C) över natten eller tills synliga kolonier har bildats.
- Skölj tallrik med destillerat vatten tills alla spår av kolonierna tas bort.
- Häll Kongo Röd (CR, 0,5% i vatten) på tvättas plattan. Se till att lägga lagom CR för att täcka plattan.
- Inkubera 15 minuter vid rumstemperatur. Inte överskrider 15 minuter för CR inkubation. Längre inkubationstider kommer att resultera i mindre distinkta glorior.
- Häll bort CR och lägga till en generös mängd (mer än tillräckligt för att täcka plattan) 1 M NaCl.
- Inkubera 15 minuter vid rumstemperatur.
- Häll av NaCl för att avslöja CMC nedbrytning glorior. För bättre upplösning halos kan längre inkubationstiderna med NaCl eller flera NaCl tvättar krävas.
- Använd en steril tandpetare, plocka aktiva enzymer kloner från befälhavaren plattan för vidare karakterisering.
3. Representativa resultat:
Ett exempel på avläsningen för hög genomströmning skärm visas i figur 3. Kloner kan identifieras som inaktiva, svagt aktiva och mycket aktiva baserat på storleken av nedbrytningen zoner. Detta är speciellt användbart om ett enzym med känd aktivitet ingår i biblioteket som referens. Som framgår här, är identifiering av aktiva enzymer robust och reproducerbar. Var dock medveten om att lämplig märkning av granskningen plattorna är oerhört viktigt. Forskaren måste kunna identifiera aktiva varianter efter tvätt kolonierna bort, för att hämta dem från befälhavaren plåten förvaras vid -80 ° C i ytterligare karakterisering. Slutligen är det svårt att bedöma på förhand förhållandet mellan verksamheter på konstgjord vs naturliga substrat. Därför måste forskaren testa alla positiva kloner på industriellt relevant material för att bestämma protein fitness.
Figur 1. Schematisk skiss av prövningsförfarandet. Celler omvandlas med en endoglucanase bibliotek och klädd selektivt för enstaka kolonier. Kloner plockas och vuxit över natten i 96 väl djupa brunnar för (1) förvaring vid -80 ° C och (2) replik bordläggning på tallrikar med CMC och IPTG att inducera endoglucanase uttryck. Aktiva kloner plockas från befälhavaren plåten förvaras vid -80 ° C.
Figur 2. Kloning och uttryck av svamp katalytiska domäner i E. coli. (A) Endoglucanase uttryck vektor. Gener har klonat in pET22b (+) (Novagen) under kontroll av T7 promotorn. (B) Rätt panelen: endoglucanase-uttryckande BL21 (DE3) kolonier. Vänster panel: CMC nedbrytning glorior efter tvätt och utveckling med Kongo Röd.
Figur 3. Provresultaten från CMC / Kongo Röd skärm. Bilder tagna av screening plattorna efter tvätt och Congo Red utveckling. Alla kolonier på screening plåtar var av liknande storlek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet beskrivs här möjliggör snabb och hög kapacitet identifiering av aktiva enzymer, med minimal manipulation. Aktivitet upptäckt är ganska känsliga, och kvalitativt avspeglar mängden aktivitet i cellen. Dess användarvänlighet gör denna metod lämplig för ett brett spektrum av enzym bibliotek, endast begränsas av funktionella uttryck i E. coli. Dessutom är aktiviteten screening av detta slag inte begränsat till svamp cellulaser, men kan anpassas för alla endoglucanase aktivitet, eller någon cellulas verksamhet för vilken det finns ett lösligt substrat (som CMC).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av Gordon och Betty Moore Foundation, och av UNCF / Merck Science Initiative.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I1284 | |
| Congo Red | Sigma-Aldrich | C6277 | |
| Carboxymethyl Cellulose | Sigma-Aldrich | 360384 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S1679 | |
| Bacto-agar | BD Biosciences | 214030 | |
| Bioassay plates | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 240845 |
References
- Atsumi, S., Hanai, T., Liao, J. C. Non-fermentative pathways for synthesis of branched-chain higher alcohols as biofuels. Nature. 451, 86-89 (2008).
- Wilson, D. B. Cellulases and biofuels. Curr Opin Biotechnol. 20, 295-299 (2009).
- Qin, Y. Engineering endoglucanase II from Trichoderma reesei to improve the catalytic efficiency at a higher pH optimum. J Biotechnol. 135, 190-195 (2008).
- Nakazawa, H. Directed evolution of endoglucanase III (Cel12A) from Trichoderma reesei. Appl Microbiol Biotechnol. 83, 649-657 (2009).
- Heinzelman, P. A family of thermostable fungal cellulases created by structure-guided recombination. Proc Natl Acad Sci. 106, 5610-5615 (2009).
- Heinzelman, P. SCHEMA recombination of a fungal cellulase uncovers a single mutation that contributes markedly to stability. J Biol Chem. 284, 26229-26233 (2009).
- Lantz, S. E. Hypocrea jecorina CEL6A protein engineering. Biotechnol Biofuels. 8, 3-20 (2010).
- Mahadevan, S. A. Site-directed mutagenesis and CBM engineering of Cel5A (Thermotoga maritima). FEMS Microbiol Lett. 287, 205-211 (2008).
- Nakazawa, H. Characterization of the catalytic domains of Trichoderma reesei endoglucanase I, II, and III, expressed in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol. 81, 681-689 (2008).
- Wang, H., Jones, R. W. Properties of the Macrophomina phaseolina endoglucanase (EGL 1) gene product in bacterial and yeast expression systems. Appl Biochem Biotechnol. 81, 153-160 (1999).
- Howard, R. L. Enzyme activity of a Phanerochaete chrysosporium cellobiohydrolase (CBHI.1) expressed as a heterologous protein from Escherichia coli. Afr J Biotechnol. 2, 296-300 (2003).
- Howard, Characterisation of a chimeric Phanerochaete chrysosporium cellobiohydrolase expressed from Escherichia coli. Afr J Biotechnol. 3, 349-352 (2004).
- Teather, R. M., Wood, P. J. Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen. Appl Env Microbiol. 43, 777-780 (1982).
- Gilkes, N. R. Mode of action and substrate specificities of cellulases from cloned bacterial genes. J Bio Chem. 259, 10455-10459 (1984).
