Summary
本研究では、透過型電子顕微鏡と負染色法のためのマイクロ波アシスト植物試料調製の組み合わせを使用して約半日での植物ウイルス病の迅速かつ明確な診断を可能にする方法を説明します。
Abstract
ウイルスによって誘発される超微細構造変化の調査は、しばしば明確植物におけるウイルス性疾患を識別する必要があります。透過型電子顕微鏡（TEM）のための従来の試料調製とそのような調査は数日間1,2を取ることができ、したがって、植物ウイルス病の迅速診断には適していません。マイクロ波固定が大幅に従来の試料調製3月5日後に観察されたと同様の超微細構造のTEM観察結果と調査のためのサンプル調製時間を削減するために使用することができます。さまざまなカスタムメイドのマイクロ波デバイスは、成功した固定およびTEM調査5-8生物試料の埋め込 みに使用することができる現在利用可能です。本研究において、我々は、それがTのためのマイクロ波アシスト試料調製を使用して約半日で葉の微細構造の変化を診断することが可能であることをタバコモザイクウイルス（TMV）感染タバコタバコ植物に実証EM。それは多くのステップがまだ手動で6月8日に実行されなければならないため、より多くの時間と労力を消費している他の利用可能なデバイスとは対照的に、ほぼ完全に自動的に5試料調製を行いますので、我々は市販のマイクロ波デバイスと、この研究を行うことを選択しました。サンプルの準備が完全に自動的に行われるように、残りのTMV感染葉や超微細構造およびサイズは、次の検査の樹液でウイルス粒子の負染色は固定と包埋時に行うことができます。
Protocol
マイクロ波アシスト試料調製
- 試料調製1の開始は、電子顕微鏡のための自動マイクロ波組織プロセッサ（ライカEM AMWは、ライカマイクロシステムズ、ウィーン、オーストリア）をプログラムする必要があります前に、TEM用マイクロ波アシスト試料調製には、次のプロトコル（表1）：
表1マイクロ波照射を用いた試料調製のためのプロトコル。別の列（左から右へ）表示：- バイアル番号（ バイアル番号nr。）バイアルは、プロセッサのカルーセルにロードされる順序を表します。
- 実際のプロセスのステップ。
- バイアル中の試薬。
- 実際の工程の時間。
- マイクロ波照射が切れる前にバイアルに到達する最高温度。
- マイクロ波照射の設定：連続=急激な温度刻みASE、設定温度を保持する。スロープ=穏やかな温度上昇は、最後に到達した最終的な温度は、温度が5を落としてまで、パルス=急速な温度上昇、電源がオフになって℃、電源、温度に到達するために再開した。
- マイクロ波照射の最大電力。
- たての試料調製プロトコル（寒天100エポキシ樹脂のため1.7を参照）で説明されているさまざまな手順のためのソリューションを用意し、プログラムされたプロトコル（表1）によると、指定バイアルにそれらを埋める、カルーセルにバイアルをロードしてから、INSERTマイクロ波組織プロセッサにカルーセル、最終的にモノモード室に最初のバイアルをロードします。
- 60MMソレンセンの3％グルタルアルデヒド（寒天サイエンティフィック（株）、スタンステッド、イギリス）のドロップでモデリングワックスプレート上にかみそりの刃でタバコモザイクウイルス（TMV）に感染したタバコタバコの葉の小さなセクション（1ミリメートル2）を切り取る室温でリン酸塩緩衝液（pH7.2）erature。
- 約200μmのメッシュ幅は指定バスケットにすぐに細かいピンセットでセクションを転送します。互いの上にバスケットを積み重ねるとモノラルモードチャンバーに挿入してください。ケアは、サンプルは常に彼らが出て乾燥させないようにロードして、バスケットのスタッキングで固定液で覆われているように注意しなければならない。
- 固定、脱水、浸透のために予めプログラムされたマイクロ波アシスト試料調製プロトコルを起動します。
- 試料調製は、マイクロ波組織プロセッサによって自動的に実行されますが、第3条（ネガティブ染色）で説明したように、残りの植物材料とネガティブ染色を続行します。
- たての説明に従って、以下の成分を混合することにより寒天100エポキシ樹脂を準備します。フィル24グラム寒天100、16グラムドデセニルコハク酸無水物、及びプラスチックカップで10グラムメチルナジック酸無水物（すべてのコンポーネントの寒天科学（株）、スタンステッド、イギリスを参照）、熱をそれへの40℃とよく混ぜる。ベンジルジメチルアミン1.2グラムを加え、よく混ぜる。試料調製プロトコルは、エンド（表1のステップ22中など）に来る直前に指定された重合形に寒天100エポキシ樹脂を充填します。
- プロトコルが終了した後（表1のステップ22の後に）モノモード室からカルーセルの最後のバイアルの中に浸透したサンプルを含む積み重ねバスケットを離します。マイクロ波装置からカローセルを取り外し、バスケットのスタックを解除し、指定された重合形に細かいピンセットを使用してそれらをロードします。ケアは、サンプルは常に彼らが出て乾燥させないように、アンスタックとロード中に寒天100エポキシ樹脂で覆われていることを注意しなければならない。
- 互いの上に重合フォームを積み重ねる。ケアは、サンプルは常に彼らが出て乾燥させないように積み重ね、ロード中に寒天100エポキシ樹脂で覆われていることを注意しなければならない。
- マイクロ波TISSのカルーセルから以前使用してバイアルを取り外しUEプロセッサは、積み重ねられたバスケットでそれをロードし、マイクロ波組織プロセッサにカルーセルを挿入します。
- あらかじめプログラムされた重合プロトコル（表1）を起動します。
- 重合は、マイクロ波組織プロセッサによって自動的に行われているが、透過型電子顕微鏡でネガティブ染色グリッドを調べる[例えばフィリップスCM10、TEM、FEI社（旧フィリップス）、アイントホーフェン、オランダ]、セクション3と4（で説明したように画像解析を行うネガティブ染色と画像解析）。
- プロトコルスタック解除後モノモード室から重合形態、重合フォームを削除して、サンプルを含む重合ブロックを削除完了です。彼らは今、ミクロトームで切片化する準備が整いました。
2。トリミングとセクショニング
- 極薄のがホルダーの外に約1cm上部に付着試料とセクショニングの個別のサンプルホルダーに1つ以上のブロックを挿入します。
- TEM（例えばライカライヘルトUltratrim、ライカマイクロシステムズ）の試料トリマーを使用してブロックを整えるように最大のブロック面。長さと（顔の大きさをブロックダイヤモンドナイフの大きさに調整する必要があります）を実現しており、できるだけ多くの葉材料を含んで幅200μmの中で1ミリメートル。
- 45°（例えばDiatomeウルトラ45、Gröpl、Tulln、オーストリア）のナイフの角度でダイヤモンドナイフを使用することにより、ウルトラミクロトーム（ライカマイクロシステムズなどライヘルトライカUltracut S）と節ブロックを。切片厚は約70〜90nmのに調整されるべきであり、切削速度は1mm / s程度である必要があります。 formvar（寒天サイエンティフィック（株））でコーティングされた銅やニッケル200平方メッシュグリッドを使用して複数のセクションを拾う。
- 部分的に2フリーCOを作成するためのNaOHでいっぱいシャーレ内で5分間、クエン酸鉛（42ミリリットル再蒸留水と8ミリリットルを1N NaOHに溶解した1.1グラムクエン酸鉛寒天科学製）を用いてグリッド上のセクションを後染色環境と15マイルのための室温で蒸留水に溶解した1％酢酸ウラニル（寒天サイエンティフィック株式会社）とnutes。各ポスト染色工程の間に1分間蒸留水でグリッドを洗ってください。空気がグリッドボックスでグリッドを乾燥させてください。
- 透過型電子顕微鏡（例えばフィリップスCM10、TEM、FEI社、アイントホーフェン、オランダ）を持つセクションを調べます。
3。逆染色法
- TMV感染葉材料として100mg約収穫と60mmSøfrensenリン酸塩緩衝液（pH7.2）100μlの中で顕微鏡スライド上にかみそりの刃で2分のための材料を均質化することにより粗汁液を準備します。
- 4ウェル以上（あるいはそれはパラフィルムの一部にホモジネートを転送することも可能である）を持つテフロン顕微鏡スライドの最初のウェルに得られたホモジネート20μlのを転送します。
- ドロップおよびインキュベーションに向いformvar（寒天サイエンティフィック株式会社）コーティングされた側とのホモジネートの上formvarコーティングされたグリッドを配置5分間、それを脱灰する。
- 200μlの60MMソレンセンリン酸緩衝液（pH7.2）を2滴の上にグリッドを配置することによって、2分ごとにグリッド2回洗浄する。
- 60MMソレンセンリン酸塩緩衝液（pH6.5）中で新しく調製した2％リンタングステン酸（寒天サイエンティフィック株式会社）溶液で1分間グリッドをインキュベートする。
- グリッドを削除し、それがグリッドボックスで空気乾燥することができます。
- 透過型電子顕微鏡（; FEI社、アイントホーフェン、オランダ例えばフィリップスCM10 TEM）でグリッドを調べます。 21000X以降の主な倍率での透過型電子顕微鏡を用いてランダムに選ばれたネガティブ染色したウイルス粒子の少なくとも10個のイメージが（少なくとも10以上ビリオンは各画像を表示する必要がある）を取る。ケアは、すべてのイメージが同じ倍率を持っていることを注意しなければなりません。
4。画像解析
- から採取した顕微鏡写真で少なくとも100ランダムに選択された単一のウイルス粒子の長さと幅を測定ネガティブ染色試料を任意の画像解析用コンピュータソフトウェアを使用して[例えばセルD（オリンパス、生命およびマテリアルサイエンスヨーロッパGmbH、Hamburg、ドイツ）粒子分析ツールを使用してまたはOptimas 6.5.1-（Media Cybernetics社株式会社メリーランド州ベセスダ米国）]。
- ネガティブ染色法とTEMにより可視化したウイルス粒子の平均の長さと幅を達成するために、平均値と標準偏差を計算します。
- 明らかにウイルス病を識別するために、文献で知られているウイルス疾患によって誘発されるウイルスおよび超微細構造変化の大きさと長さと微細構造の特徴を（2.5）で得られた比較。
5。代表の結果：
などのマイクロ波アシスト試料調製典型的なTMV誘起微細構造の変化の後に並列状に配列ビリオンを含む大きな領域は、感染した喫煙者のサイトゾルに透過型電子顕微鏡で観察することができたタバコ細胞（図1A）。さらに、TMVに感染葉の粗汁液でTMV粒子は負染色（図1B）の後屈曲、棒状構造として観察することができた。 100ウイルス粒子画像解析の幅が長さ17nmと280nmのである（図2）、TMVの平均サイズを明らかにした。 TMV感染細胞における超微細構造と本研究で観察されたビリオンのサイズはタバコと以前に文献9月15日に報告されたTMV粒子の大きさの範囲内で、TMV誘起微細構造の特性と一致していることがわかった。
TMVに感染した葉の細胞およびビリオンの図1透過型電子顕微鏡写真。 a）画像は、マイクロ波アシスト植物試料調製後のタバコタバコのTMVに感染した葉肉葉細胞の超微細構造を示しています。細胞質に蓄積された平行に整列ビリオンの大面積に注意してください。でんぷんを使用したC =葉緑体（ST）、M =ミトコンドリア、核、N = V =液胞、バー=2μmの。 B）のイメージは、感染した葉の樹液でネガティブ染色により検出したビリオンを示しています。
図2ビリオンの相対的な大きさ。彼らは電子顕微鏡で登場しましたように、負は、感染した葉の樹液を染色した後、TMV粒子の長さと幅の相対的な分布。 （長さ/幅の平均値±標準偏差）平均値は、100ビリオンから算出した。
Discussion
TEM用マイクロ波アシスト植物試料の調製は、数時間以内に3,4,16、高速かつ信頼性の高い超微細構造のデータを提供することが実証されています。本研究で使用した方法で達成小器官と膜の微細構造保持には、3日以上〜約2時間サンプルの固定と包埋時間の大幅な削減という利点を持つ5,15従来とcryofixedサンプルに類似していた。これは文学で現在利用可能なTEM用最速試料調製プロトコルを表します。本研究で述べた方法は、TMV誘起微細構造の変化およびウイルス剤自体の明確かつ迅速な同定を可能にしたネガティブ染色法とTEM用マイクロ波アシスト植物試料調製を組み合わせました。 TMVは超微細構造変化が電気伝送での固定の開始後約4時間以内に、トリミングセクショニングと後染色した後に調査される可能性が誘導されるトロン顕微鏡。完全自動試料作成モードを使用すると、ウイルス剤のサイズと幅を決定するために、暫定的にネガティブ染色を実施する研究者を解放した。したがって、私たちは、この方法は植物植物病理学における農業と科学的な実験では、将来の使用のために非常に重要である約半日での植物ウイルス病の明確かつ迅速な診断を可能と結論付けることができます。この方法はまた、動物とヒトの疾患の迅速な診断のために使用することができるとして、それは医療や獣医病理学の将来のアプリケーションのための大きな可能性を秘めています。
Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、オーストリア科学基金（FWF、BZにP20619とP22988）によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glutaraldehyde | Agar Scientific | R1312 | |
| Osmium tetroxide | Agar Scientific | R1022 | |
| Agar 100 resin | Agar Scientific | R1043 | |
| Dodecenyl succinic anhydride | Agar Scientific | R1051 | |
| Methyl nadic anhydride | Agar Scientific | R1081 | |
| Benzyl dimethylamine | Agar Scientific | R1060 | |
| Lead citrate | Agar Scientific | R1210 | |
| Uranyl acetate | Agar Scientific | R1260A | |
| Phosphotungstic acid | Agar Scientific | R1213 | |
| Formvar | Agar Scientific | R1202 | |
| Leica EM AMW | Leica Microsystems | ||
| Leica (Reichert) Ultratrim | Leica Microsystems | Newer model is available | |
| Leica (Reichert) Ultracut S | Leica Microsystems | Newer model is available | |
| Diatome Ultra 45 | Gröpl | ||
| Philips CM10 TEM | FEI | Newer model is available | |
| Cell D | Olympus Corporation | ||
| Optimas 6.5.1 | Media Cybernetics Inc. | Newer version is available |
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