Summary
इस अध्ययन के एक तरीका है कि माइक्रोवेव संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और नकारात्मक धुंधला हो जाना तरीकों के लिए सहायता संयंत्र नमूना तैयार करने का एक संयोजन का उपयोग करके संयंत्र के बारे में आधे से एक दिन में वायरस रोगों के तेजी से और स्पष्ट निदान की अनुमति देता है वर्णन करता है.
Abstract
Ultrastructural वायरस से प्रेरित परिवर्तन की जांच अक्सर स्पष्ट रूप से पौधों में वायरल रोगों की पहचान करने के लिए आवश्यक हैं. संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) के लिए पारंपरिक नमूना तैयारी के साथ इस तरह की जाँच कई दिनों 1,2 लेने के लिए और कर सकते हैं इसलिए संयंत्र वायरस रोगों के तेजी से निदान के लिए अनुकूल नहीं है. माइक्रोवेव निर्धारण के काफी पारंपरिक नमूना 3-5 तैयारी के बाद मनाया के रूप में इसी तरह ultrastructural परिणामों के साथ मंदिर की जांच के लिए नमूना तैयारी के समय को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. कई अलग अलग कस्टम बनाया माइक्रोवेव उपकरणों वर्तमान में उपलब्ध हैं जो सफल निर्धारण और मंदिर 5-8 जांच के लिए जैविक नमूने के embedding के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस अध्ययन में हम तंबाकू मोज़ेक वायरस पर प्रदर्शित (TMV) तमाखू संयंत्रों संक्रमित है कि यह संभव है के बारे में आधे से एक दिन में टी के लिए माइक्रोवेव सहायता नमूना तैयार करने का उपयोग करके पत्तियों में ultrastructural परिवर्तन का निदानEM. हम एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माइक्रोवेव उपकरण के साथ इस अध्ययन करने के लिए चुना है क्योंकि यह अन्य उपलब्ध उपकरणों जहां कई कदम अभी भी 6-8 मैन्युअल रूप से प्रदर्शन किया है और इसलिए अधिक समय और श्रम लेने के विपरीत नमूना तैयारी लगभग पूरी तरह से स्वचालित रूप से 5 से करता है. नमूना तैयार करने के रूप में किया जाता है शेष TMV संक्रमित पत्तियों और फैटी और आकार के निम्नलिखित परीक्षा के रस में वायरल कणों के पूरी तरह से स्वचालित नकारात्मक धुंधला हो निर्धारण और embedding के दौरान किया जा सकता है.
Protocol
माइक्रोवेव सहायता नमूना तैयारी
- इससे पहले नमूना एक की तैयारी शुरू करने के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए स्वत: माइक्रोवेव ऊतक प्रोसेसर (Leica EM AMW, Leica माइक्रोसिस्टम्स, वियना, आस्ट्रिया) कार्यक्रम की जरूरत है माइक्रोवेव मंदिर के लिए सहायता नमूना तैयार करने के लिए निम्नलिखित प्रोटोकॉल (1 टेबल) के साथ:
तालिका 1 नमूना तैयार करने के लिए प्रोटोकॉल माइक्रोवेव विकिरण का उपयोग कर. विभिन्न स्तंभों शो (बाएं से दाएं):- शीशी संख्या (शीशी nr.) क्रम में शीशी प्रोसेसर के हिंडोला में भरी हुई है का प्रतिनिधित्व करता है.
- वास्तविक प्रक्रिया के चरण.
- शीशियों में अभिकर्मकों.
- वास्तविक कदम की अवधि.
- अधिकतम तापमान जो शीशी में पहुँच जाता है माइक्रोवेव विकिरण से पहले बंद कर दिया है.
- माइक्रोवेव विकिरण सेटिंग: सतत = तेजी से तापमान increase, सेट तापमान धारण, ढाल = कोमल तापमान में वृद्धि, अंतिम अंत में पहुँच तापमान, स्पंदित = तेजी से तापमान में वृद्धि बिजली, बंद कर दिया जब तक तापमान 5 गिरा ° सी शक्ति, तापमान तक पहुँचने फिर से शुरू.
- माइक्रोवेव विकिरण की अधिकतम शक्ति.
- हौसले से अलग नमूना तैयारी प्रोटोकॉल (अग्रवाल 100 epoxy राल के लिए 1.7 देखें) में वर्णित चरणों के लिए समाधान तैयार करने के लिए नामित शीशियों में उन्हें क्रमादेशित प्रोटोकॉल (1 टेबल) के अनुसार भरने, हिंडोला पर शीशियों लोड, और फ़िर माइक्रोवेव ऊतक प्रोसेसर, और में हिंडोला अंत में मोनो मोड कक्ष में 1 शीशी लोड.
- निकोटियाना 60mm सॉरेनसेन में 3% glutaraldehyde (अगर वैज्ञानिक लिमिटेड Stansted, इंग्लैंड) की एक बूंद में एक मॉडलिंग मोम की प्लेट पर एक रेजर ब्लेड के साथ तंबाकू मोज़ेक वायरस (TMV) से संक्रमित tabacum से कट पत्तियों के छोटे वर्गों (2 1mm) कमरे Temp पर फॉस्फेट बफर (7.2 पीएच)erature.
- लगभग 200μm की एक जाल चौड़ाई के साथ नामित टोकरी में तुरंत ठीक चिमटी के साथ वर्गों स्थानांतरण. एक दूसरे के शीर्ष पर टोकरी ढेर और उन्हें कक्ष मोनो मोड में डालें. ध्यान रखा जाना चाहिए कि नमूने लगातार लोड हो रहा है और टोकरी के stacking के दौरान इतना है कि वे बाहर सूखी नहीं लगानेवाला समाधान के साथ कवर कर रहे हैं.
- पहले क्रमादेशित माइक्रोवेव निर्धारण, निर्जलीकरण, और घुसपैठ के लिए सहायता नमूना तैयारी प्रोटोकॉल प्रारंभ.
- जबकि नमूना तैयारी स्वचालित रूप से माइक्रोवेव ऊतक प्रोसेसर के द्वारा किया जाता है शेष संयंत्र सामग्री के साथ नकारात्मक धुंधला हो जाना के रूप में 3 खंड (नकारात्मक धुंधला हो) में वर्णित के साथ जारी है.
- गर्मी: भरण 24g अग्रवाल 100, 16g dodecenyl succinic एनहाइड्राइड, एक प्लास्टिक के कप में और 10 ग्राम मिथाइल nadic एनहाइड्राइड (सभी घटकों के लिए अगर वैज्ञानिक लिमिटेड Stansted, इंग्लैंड देखें), हौसले से निम्नलिखित के रूप में वर्णित घटकों के मिश्रण से अग्रवाल 100 epoxy राल तैयार यह करने के लिए40 डिग्री सेल्सियस और यह अच्छी तरह से मिश्रण. लोबान dimethylamine की 1.2g जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से. नामित polymerization में अगर 100 epoxy राल भरें रूपों बस से पहले नमूना तैयारी प्रोटोकॉल एक अंत (जैसे 1 तालिका में 22 कदम दौरान) के लिए आता है.
- प्रोटोकॉल के बाद समाप्त हो गया है (1 तालिका में 22 कदम के बाद) stacked हिंडोला की अंतिम शीशी में घुसपैठ नमूने मोनो मोड कक्ष से युक्त टोकरियाँ जारी. माइक्रोवेव डिवाइस से हिंडोला निकालें, बास्केट unstack और नामित polymerization रूपों में ठीक चिमटी का उपयोग करके उन्हें लोड. ध्यान रखा जाना चाहिए कि नमूने हमेशा unstacking और इसलिए लोड हो रहा है कि वे बाहर सूखी नहीं के दौरान अग्रवाल 100 epoxy राल के साथ कवर कर रहे हैं.
- एक दूसरे के ऊपर पर polymerization रूपों हो चुकी है. ध्यान रखा जाना चाहिए कि नमूने हमेशा stacking और लोड हो रहा है इतना है कि वे बाहर सूखी नहीं के दौरान अग्रवाल 100 epoxy राल के साथ कवर कर रहे हैं.
- माइक्रोवेव tiss का हिंडोला से पहले से इस्तेमाल किया शीशियों निकालेंue प्रोसेसर, यह खड़ी टोकरी के साथ लोड और माइक्रोवेव ऊतक प्रोसेसर में हिंडोला डालें.
- पहले क्रमादेशित polymerization प्रोटोकॉल (1 तालिका) प्रारंभ.
- जबकि polymerization माइक्रोवेव ऊतक प्रोसेसर द्वारा स्वचालित रूप से किया जाता है, एक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ नकारात्मक दाग ग्रिड की जांच [उदाहरण के लिए फिलिप्स CM10 मंदिर, फी (पूर्व फिलिप्स), आइंटहॉवन, नीदरलैंड] और धारा 3 और 4 (में वर्णित के रूप में छवि विश्लेषण प्रदर्शन नकारात्मक धुंधला हो जाना और छवि विश्लेषण).
- बाद प्रोटोकॉल समाप्त हो गया है मोनो मोड कक्ष से polymerization प्रपत्रों को हटाने, unstack polymerization रूपों और polymerized नमूने युक्त ब्लॉक निकालें. वे अब एक सूक्ष्म तक्षणी साथ sectioned बनने के लिए तैयार कर रहे हैं.
2. Trimming और सेक्शनिंग
- अलग नमूना धारकों में ultrathin के बारे में शीर्ष चिपके पर नमूने के साथ धारक की 1cm सेक्शनिंग बाहर करने के लिए एक या अधिक ब्लॉक डालें.
- मंदिर (जैसे Leica रीचर्ट Ultratrim, Leica माइक्रोसिस्टम्स) के लिए एक नमूना trimmer के साथ ब्लॉक छाँटो इतनी है कि अधिकतम के एक ब्लॉक चेहरा. लंबाई और चौड़ाई में 200μm जो पत्ती के रूप में ज्यादा सामग्री (चेहरे का आकार ब्लॉक करने के लिए हीरे की चाकू के आकार को समायोजित किया जा आवश्यकता हो सकती है) संभव के रूप में हासिल की है में 1mm.
- ब्लॉक 45 ° (जैसे Diatome अल्ट्रा 45, Gröpl, Tulln, ऑस्ट्रिया) के एक चाकू कोण में एक हीरे की चाकू का उपयोग करके, एक ultramicrotome (Leica माइक्रोसिस्टम्स जैसे रीचर्ट Leica Ultracut एस) के साथ धारा. धारा मोटाई के बारे में 70 90nm करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए और काटने गति / 1mm के आसपास होना चाहिए. (अगर वैज्ञानिक लिमिटेड) एक formvar लेपित तांबे या निकल 200 वर्ग जाल ग्रिड के साथ कई वर्गों उठाओ.
- एक पेट्री डिश में 5 मिनट के आंशिक रूप से NaOH के साथ भरा एक सीओ 2 मुक्त बनाने के लिए, सीसा साइट्रेट (1.1g नेतृत्व 42ml दोहरा आसुत जल और 8ml 1N NaOH में भंग साइट्रेट अगर वैज्ञानिक लिमिटेड) के साथ ग्रिड पर वर्गों के बाद दाग पर्यावरण और 15 मील के लिएnutes 1% uranyl एसीटेट (अगर वैज्ञानिक लिमिटेड) के साथ कमरे के तापमान पर आसुत जल में भंग. आसुत जल के साथ हर कदम के बाद धुंधला के बीच में 1 मिनट के लिए ग्रिड धो लें. एयर एक ग्रिड बॉक्स में ग्रिड सूखी.
- एक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (जैसे फिलिप्स CM10 मंदिर, फी, आइंटहॉवन, नीदरलैंड) के साथ वर्गों की जांच करते हैं.
3. नकारात्मक धुंधला हो जाना
- TMV संक्रमित पत्ता सामग्री के 100mg के बारे में और एक खुर्दबीन स्लाइड पर 100μl 60mm Søfrensen फॉस्फेट बफर (7.2 पीएच) में एक रेजर ब्लेड के साथ 2 मिनट के लिए सामग्री homogenizing द्वारा कच्चे सार तैयार हार्वेस्ट.
- 4 या अधिक कुओं (वैकल्पिक रूप से यह भी संभव है parafilm के एक टुकड़े पर homogenate हस्तांतरण) के साथ एक teflon लेपित खुर्दबीन स्लाइड की अच्छी तरह से पहले पर जिसके परिणामस्वरूप homogenate की 20μl स्थानांतरण.
- (अगर वैज्ञानिक लिमिटेड) formvar लेपित ड्रॉप और incu ओर का सामना करना पड़ पक्ष के साथ homogenate के शीर्ष पर एक formvar लेपित ग्रिड रखेंयह 5 मिनट के लिए रोष.
- ग्रिड 200μl 60mm सॉरेनसेन फॉस्फेट बफर (7.2 पीएच) की दो बूंदों के शीर्ष पर ग्रिड रखने द्वारा 2 मिनट के लिए 2 बार धोएं.
- हौसले से तैयार 2% phosphotungstic एसिड (अगर वैज्ञानिक लिमिटेड) 60mm सॉरेनसेन फॉस्फेट बफर (6.5 पीएच) में समाधान के साथ 1 मिनट के लिए ग्रिड सेते हैं.
- ग्रिड निकालें और यह एक ग्रिड बॉक्स में शुष्क हवा करने के लिए अनुमति देते हैं.
- एक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (; फी, आइंटहॉवन, नीदरलैंड जैसे फिलिप्स CM10 मंदिर) के साथ ग्रिड जांच करते हैं. 21000X या अधिक की एक प्राथमिक बढ़ाई संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ बेतरतीब ढंग से चुनी नकारात्मक दाग virions की कम से कम 10 छवियों (प्रत्येक छवि पर कम से कम 10 या अधिक virions दिखाई जानी चाहिए) ले लो. ध्यान रखा जाना चाहिए कि सभी छवियों को एक ही बढ़ाई है.
4. छवि विश्लेषण
- से लिया micrographs पर और कम से कम 100 बेतरतीब ढंग से चुनी एक वायरस कणों की लंबाई और चौड़ाई उपायकिसी भी छवि विश्लेषण कंप्यूटर सॉफ्टवेयर का उपयोग करके नकारात्मक दाग नमूने जैसे [डी कण विश्लेषण उपकरण या Optimas (ओलिंप, जीवन और सामग्री विज्ञान यूरोप GmbH, हैम्बर्ग, जर्मनी) के साथ सेल 6.5.1 (मीडिया Cybernetics इंक, बेथेस्डा, मेरीलैंड, संयुक्त राज्य अमेरिका)].
- क्रम में एक औसत और वायरस कणों नकारात्मक धुंधला के तरीकों और मंदिर से कल्पना की लंबाई चौड़ाई को प्राप्त करने का मतलब है और मानक विचलन की गणना.
- वायरस क्रम में साहित्य में जाना जाता है के लिए स्पष्ट रूप से वायरस रोगों की पहचान रोगों से प्रेरित वायरस और ultrastructural परिवर्तन के आकार के साथ लंबाई और ultrastructural सुविधाओं (2.5 में प्राप्त) से तुलना कर लें.
5. प्रतिनिधि परिणाम:
माइक्रोवेव मदद से इस तरह के रूप में नमूना तैयार करने ठेठ TMV प्रेरित ultrastructural परिवर्तन के बाद समानांतर रूप में गठबंधन virions वाले बड़े क्षेत्रों संक्रमित तंबाकू cytosol में संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ देखा जा सकता हैएक tabacum कोशिकाओं (छवि 1 ए). इसके अतिरिक्त, TMV संक्रमित कच्चे रस में पत्ते TMV कण कुटिल नकारात्मक धुंधला हो जाना के बाद छड़ के आकार का संरचनाओं (छवि 1 बी) के रूप में देखा जा सकता है. 100 वायरस कणों की छवि विश्लेषण 280nm की लंबाई और चौड़ाई में 17nm में (2 छवि) एक TMV के लिए औसत आकार का पता चला. TMV से संक्रमित कोशिकाओं और इस अध्ययन में मनाया virions के आकार में फैटी तम्बाकू और TMV कणों के आकार की सीमा में TMV प्रेरित ultrastructural गुणों के साथ अनुसार पहले 9-15 साहित्य में सूचना दी पाए गए.
चित्रा TMV संक्रमित पत्ता कोशिकाओं और virions 1 ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन micrographs. ए) छवि माइक्रोवेव सहायता संयंत्र नमूना तैयारी के बाद तमाखू की TMV संक्रमित मेज़ोफिल पत्ता कोशिकाओं के फैटी से पता चलता है. नोट समानांतर गठबंधन virions जो cytosol में जमा के बड़े क्षेत्र.स्टार्च के साथ सी = क्लोरोप्लास्ट (अनुसूचित जनजाति), एम = mitochondrion, एन = नाभिक, वी = रिक्तिका बार = 2μm. बी) छवि virions जो नकारात्मक धुंधला हो जाना द्वारा संक्रमित पत्तियों का रस में पाया गया पता चलता है.
चित्रा 2 virions के सापेक्ष आकार. TMV कणों के नकारात्मक धुंधला हो संक्रमित पत्तियों का सार के रूप में वे इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में छपी के बाद लंबाई और चौड़ाई के सापेक्ष वितरण. मूल्यों मतलब (लंबाई चौड़ाई / ± मानक विचलन मतलब है) 100 virions से गणना की गई.
Discussion
माइक्रोवेव मंदिर के लिए सहायता संयंत्र नमूना तैयार करने के लिए कुछ 3,4,16 घंटे के भीतर तेज और विश्वसनीय ultrastructural डेटा की आपूर्ति करने के लिए सिद्ध किया गया है. organelles झिल्ली और इस अध्ययन में इस्तेमाल की विधि के साथ प्राप्त की ठीक संरचनात्मक संरक्षण पारंपरिक और cryofixed नमूने के लिए इसी तरह की थी नमूना निर्धारण में भारी कमी का लाभ के साथ 5,15 और 3 दिन या उससे अधिक समय से समय के बारे में 2 घंटे के लिए embedding. यह वर्तमान में उपलब्ध साहित्य मंदिर के लिए तेजी नमूना तैयारी प्रोटोकॉल का प्रतिनिधित्व करता है. इस अध्ययन में वर्णित विधि माइक्रोवेव नकारात्मक धुंधला हो जाना तरीकों जो TMV प्रेरित ultrastructural परिवर्तन और वायरल एजेंट ही एक स्पष्ट और तेजी से पहचान की अनुमति के साथ मंदिर के लिए सहायता संयंत्र नमूना तैयार करने के लिए संयुक्त. TMV प्रेरित ultrastructural परिवर्तन trimming, सेक्शनिंग और बाद धुंधला संचरण चुनाव में नियतन की शुरुआत के बाद लगभग 4 घंटे के भीतर जाने के बाद जांच की जा सकता हैtron खुर्दबीन. पूरी तरह से स्वचालित नमूना तैयार मोड का उपयोग शोधकर्ता मुक्त करने के लिए अंतरिम में नकारात्मक धुंधला हो जाना का संचालन करने के लिए और वायरल एजेंट के आकार चौड़ाई निर्धारित. इस प्रकार, हम यह निष्कर्ष निकाल सकते हैं कि इस विधि के संयंत्र के बारे में आधे से एक दिन जो संयंत्र phytopathology में कृषि और वैज्ञानिक प्रयोगों में भविष्य के उपयोग के लिए महान महत्व का है में वायरस रोगों के एक स्पष्ट और तेजी से निदान की अनुमति देता है. इस विधि के रूप में भी जानवर और मानव रोगों के तेजी से निदान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है यह चिकित्सा और पशु चिकित्सा विकृति में भविष्य के आवेदन के लिए एक बड़ी क्षमता है.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम ऑस्ट्रियाई विज्ञान कोष (FWF, P20619 और P22988 BZ) द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glutaraldehyde | Agar Scientific | R1312 | |
| Osmium tetroxide | Agar Scientific | R1022 | |
| Agar 100 resin | Agar Scientific | R1043 | |
| Dodecenyl succinic anhydride | Agar Scientific | R1051 | |
| Methyl nadic anhydride | Agar Scientific | R1081 | |
| Benzyl dimethylamine | Agar Scientific | R1060 | |
| Lead citrate | Agar Scientific | R1210 | |
| Uranyl acetate | Agar Scientific | R1260A | |
| Phosphotungstic acid | Agar Scientific | R1213 | |
| Formvar | Agar Scientific | R1202 | |
| Leica EM AMW | Leica Microsystems | ||
| Leica (Reichert) Ultratrim | Leica Microsystems | Newer model is available | |
| Leica (Reichert) Ultracut S | Leica Microsystems | Newer model is available | |
| Diatome Ultra 45 | Gröpl | ||
| Philips CM10 TEM | FEI | Newer model is available | |
| Cell D | Olympus Corporation | ||
| Optimas 6.5.1 | Media Cybernetics Inc. | Newer version is available |
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