Summary
이 연구는 전송 전자 현미경과 부정적인 착색 방법에 대한 전자 지원 식물 샘플 준비의 조합을 사용하여 절반 정도 하루에 식물 바이러스 질병의 신속하고 명확한 진단을 할 수있는 방법을 설명합니다.
Abstract
바이러스에 의해 유도 ultrastructural 변화 조사는 종종 명확 식물 바이러스 질병을 식별 할 수 필요합니다. 전송 전자 현미경 (TEM)에 대한 기존의 샘플 준비 등 조사가 며칠 1,2 걸릴 수 있으므로 식물 바이러스 질환의 급속한 진단에 적합하지 않습니다. 전자 고정이 대폭 통상 샘플 준비 3-5 후 관찰과 유사한 ultrastructural 결과와 TEM 조사를위한 샘플 준비 시간을 단축 할 수 있습니다. 여러 가지 맞춤 제작 전자 장치는 성공적으로 고정 및 TEM 조사 5-8에 대한 생물학적 시료의 삽입을 위해 사용할 수있는 현재 사용할 수 있습니다. 이 연구에서 우리는 담배 모자이크 바이러스에 설명 (TMV)는 T에 대한 전자 지원 샘플 준비를 사용하여 절반 정도 하루에 잎의 ultrastructural 변경을 진단하는 것이 가능하다는 것을 Nicotiana tabacum의 식물을 감염EM. 그 많은 단계를 수동으로 6-8을 수행해야하므로 더 많은 시간과 노동력이 소요있는 다른 사용 가능한 장치에 대조적으로 거의 완벽하게 자동으로 5 샘플 준비를 수행으로 우리는 상업적으로 이용 가능한 전자 장치와 본 연구를 수행하도록 선택했습니다. 샘플 준비가 나머지 TMV에 감염된 잎과 ultrastructure 및 크기의 다음 시험의 수액에서 바이러스 입자의 완전 자동으로 부정적인 염색법을 수행으로 고정하고 삽입하는 동안 수행 할 수 있습니다.
Protocol
전자 지원 샘플 준비
- 샘플 준비 하나의 시작 전자 현미경에 대한 자동 전자 조직 프로세서 (Leica EM AMW, Leica 마이크로 시스템즈, 비엔나, 오스트리아)을 프로그램 할 필요가 전에 TEM에 대한 전자 지원 샘플 준비에 대한 다음 프로토콜 (표 1) :
표 1. 전자 방사선을 사용하여 샘플 준비를위한 프로토콜. 다른 열 (왼쪽에서 오른쪽으로) 표시 :- 유리 병 번호 (비알의 NR은.) 유리 병은 프로세서의 회전 목마에로드되는 순서를 나타냅니다.
- 실제 프로세스의 단계.
- 병에 시약.
- 실제 단계의 기간.
- 전자 조사가 해제되기 전에 병에 도달 최대 온도.
- 전자 방사선 설정 : 연속 = 급속한 온도 increASE, 설정 온도를 개최, 슬로프 = 부드러운 온도 상승, 끝 부분에 도달 최종 온도는, 온도가 5 감소 할 때까지 펄스 = 신속한 온도 상승, 전원이 꺼져 ° C, 전원이 온도에 도달 재개 할 수 있습니다.
- 전자 조사의 최대 전력.
- 갓 샘플 준비 프로토콜 (한천 100 에폭시 수지에 1.7 참조)에 설명 된 여러 단계의 솔루션을 준비, 프로그래밍 프로토콜 (표 1)에 따라 지정된 병에 넣어 작성, 회전 목마에 튜브를로드 한 다음을 삽입 전자 레인지 조직 프로세서, 그리고에 회전 목마가 마침내 모노 모드 챔버 내로 첫 번째 병을로드합니다.
- 60mM 소렌슨 3 %의 글 루타 알데히드 (한천 과학 (주), 스탠스 테드, 영국)의 드롭 모델링 왁스 판에 면도날과 담배 모자이크 바이러스 (TMV)에 감염된 Nicotiana의 tabacum에서 잎의 작은 섹션 (1mm 2) 잘라 온도는 실온에서 인산 버퍼 (산도 7.2)erature.
- 즉시 약 200μm의 메쉬 폭 지정 바구니에 고급 핀셋으로 섹션을 전송합니다. 서로의 상단에있는 바구니를 스택과 모노 모드 챔버에 삽입. 케어는 샘플을 지속적 아웃 건조하지 않도록로드 및 바구니의 스태킹 동안 정착액 솔루션으로 덮여 있다는주의해야합니다.
- 고정, 탈수와 침투에 대한 이전에 프로그램 된 전자 레인지 지원 샘플 준비 절차를 시작합니다.
- 샘플 준비가 전자 조직 프로세서에 의해 자동으로 수행되는 동안 섹션 3 (부정적인 염색법)에 설명 된대로 나머지 공장 소재 부정적인 착색를 계속합니다.
- 플라스틱 컵에 기입 24g 한천 100, 16g dodecenyl succinic 무수물, 그리고 10g 메틸 nadic 무수물 (모든 구성 요소에 대한 한천 과학 (주), 스탠스 테드, 영국 참조), 열 : 신선 다음과 같은 구성 요소 설명 된대로를 혼합하여 한천 100 에폭시 수지를 준비 거기에40 ° C와 잘 섞는다. 벤질 dimethylamine의 1.2g을 추가하고 철저하게 섞는다. 샘플 준비 프로토콜이 종료 (예 : 표 1의 단계 22시)에있어서 바로 전에 지정된 중합에 한천 100 에폭시 수지를 기입은 형성한다.
- 프로토콜이 완료되면 (표 1에서 단계 22 이후) 모노 모드 챔버에서 회전 목마의 마지막 유리 병에 침투 샘플을 포함하는 스택 바구니를 놓습니다. 전자 장치에서 회전 목마를 제거, 바구니를 제거시켜야하고 지정된 중합 형태로 고급 핀셋을 이용하여로드합니다. 케어는 샘플이 항상 unstacking하고 아웃 건조하지 않도록로드하는 동안 한천 100 에폭시 수지로 덮여 있다는주의해야합니다.
- 서로의 상단에있는 중합 양식을 쌓아. 케어는 샘플을 항상 스택과 그들이 건조하지 않도록로드하는 동안 한천 100 에폭시 수지로 덮여 있다는주의해야합니다.
- 전자 레인지 tiss의 회전 목마에서 이전에 사용 된 튜브를 제거UE 프로세서는 스택 바구니로로드하고 전자 레인지 조직 프로세서에 회전 목마를 삽입합니다.
- 이전에 프로그램 된 중합 프로토콜 (표 1)를 시작합니다.
- 중합은 전자 레인지 조직 프로세서에 의해 자동으로 수행하는 동안 전송 전자 현미경과 부정적인 스테인드 격자를 검토 [예 필립스 CM10 TEM, 페이 (구 필립스), 아인트호벤, 네덜란드]와 섹션 3과 4 (에 설명 된대로 이미지 분석을 수행 부정적인 착색 및 이미지 분석).
- 프로토콜은 제거시켜야한다, 모노 모드 챔버에서 중합 양식을 중합 양식을 제거하고 샘플을 포함 polymerized 블록을 제거 완료되면. 그들은 지금 마이크로톰으로 sectioned 될 준비가 된 것입니다.
2. 트리밍 및 sectioning
- ultrathin의 홀더에 대해 상단 그걸 고정에 샘플로 1cm를 sectioning에 대해 별도의 샘플 홀더에 하나 이상의 블록을 삽입합니다.
- TEM (예 : Leica 라이 Ultratrim, Leica 마이크로 시스템즈)에 대한 표본 트리머로 블록을 잘라 있도록 최대의 블록 얼굴. 길이 (얼굴 크기를 차단 다이아몬드 나이프의 크기에 조정해야 할 수도) 달성 가능한 한 많은 잎 물질을 포함하는 폭 200μm의 1mm.
- 45 ° (예 : Diatome 울트라 45, Gröpl, Tulln, 오스트리아)의 칼 각도로 다이아몬드 칼을 사용하여, ultramicrotome (Leica 마이크로 시스템즈 예 라이 Leica Ultracut S)와 제 블록을. 섹션의 두께는 약 70 ~ 90nm로 조정해야하며 절단 속도는 1mm / s의 주변에 있어야합니다. formvar (한천 과학 (주)) 코팅 구리 또는 니켈 321 평방 메쉬 그리드에 여러 섹션을 선택합니다.
- 일부 2 무료 CO를 만들 NaOH로 가득 배양 접시에 5 분, 리드 구연산 (42ml 더블 증류수와 8ml 1N NaOH에 용해 1.1g 리드 구연산 한천 과학 (주))와 그리드의 섹션을 포스트 얼룩 환경 15 마일에1 % uranyl 아세트산 (한천 과학 (주))와 nutes는 상온에서 증류수에 용해. 각 포스트 착색 단계 사이에 1 분 동안 증류수로 격자를 씻으십시오. 공기는 그리드 상자에 격자를 건조.
- 전송 전자 현미경 (예 : 필립스 CM10 TEM, 페이, 아인트호벤, 네덜란드)와 섹션을 확인합니다.
3. 음성 염색법
- TMV에 감염된 잎 소재의 100mg 약 60mM 인산 Søfrensen 버퍼 (산도 7.2)의 100μl의 현미경 슬라이드에 면도날을 2 분 동안 자료를 homogenizing으로 원유 수액을 준비 수확.
- 4 개 이상의 우물 (또는 그 parafilm의 한 부분에 homogenate를 전송하는 것도 가능합니다)와 테플론 코팅 현미경 슬라이드의 잘 처음에 결과 homogenate의 20μl를 전송합니다.
- 드롭 및 incu으로 직면하고있는 formvar (한천 과학 (주)) 코팅 된면으로 homogenate의 상단에 formvar 코팅 그리드를 배치5 분을 덜다.
- 200μl 60mM 인산 소렌슨 버퍼 (산도 7.2) 두 방울의 상단에있는 격자를 배치하여 격자에게 이분 각각에 대한 2 번 씻으십시오.
- 신선하게 조리 된 2% phosphotungstic 산 (한천 과학 (주)) 60mM 인산 소렌슨 버퍼 (산도 6.5)에 솔루션을 1 분 격자를 품다.
- 그리드를 제거하고 그리드 상자에 드라이를 방송 할 수 있습니다.
- 전송 전자 현미경 (; 페이, 아인트호벤, 네덜란드 필립스 등 CM10 TEM)으로 격자를 검사합니다. 21000X 이상의 기본 배율에서 전송 전자 현미경으로 무작위로 선택한 부정적인 스테인드 virions의 적어도 10 이미지를 (적어도 10 명 이상 virions 각 이미지에 표시됩니다)보세요. 주의 모든 이미지가 동일한 배율을 가지고 촬영해야합니다.
4. 이미지 분석
- 에서 가져온 micrographs에 최소 100 무작위로 선택된 하나의 바이러스 입자의 길이와 너비를 측정모든 이미지 분석 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 부정적인 스테인드 샘플 입자 분석 도구 또는 Optimas과 [예를 들면 세포 D (올림푸스, 생활과 재료 과학 유럽 GmbH의, 함부르크, 독일) 6.5.1-(미디어 인공 이식 주식회사 메릴랜드 주 베데스다, USA)].
- 부정적인 착색 방법 및 TEM으로 시각화 바이러스 입자의 평균 길이와 너비를 달성하기 위해 수단과 표준 편차를 계산합니다.
- 명확하게 바이러스 질병을 파악하기 위해 문헌에 알려진 바이러스 질환에 의해 유도 바이러스와 ultrastructural 변경의 크기와 길이와 ultrastructural 기능을 (2.5에서 얻은) 비교합니다.
5. 대표 결과 :
같은 전자 지원 샘플 준비 전형적인 TMV 유발 ultrastructural 변경 한 후 병렬 형태로 정렬 virions을 포함하는 넓은 영역은 감염된 담배의의 세포 기질에 전송 전자 현미경으로 관찰 할 수tabacum 세포 (그림 1A). 또한 TMV에 감염된의 원유 SAP에서 TMV 입자가 부정적인 착색 후 flexuous, 막대 모양의 구조 (그림의 1B)로 관찰 할 수 둡니다. 100 바이러스 입자의 이미지 분석은 폭 길이와 17nm에서 280nm (그림 2)의 TMV에 대한 평균 크기를 발표했다. TMV에 감염된 세포와 본 연구에서 관찰 virions의 크기에 ultrastructure는 TMV 입자의 담배 크기의 범위에서 TMV 유발 ultrastructural 특성에 따라 이전에 문학 9-15에보고 된 것으로되었다.
TMV에 감염된 잎 세포와 virions의 그림 1. 전송 전자 micrographs. A) 이미지 Nicotiana tabacum의 전자 레인지 지원 식물 샘플 준비 후의 TMV에 감염된 mesophyll 잎 세포의 ultrastructure을 보여줍니다. 세포 기질에 축적 된 병렬 정렬 virions의 넓은 지역을 확인합니다.C 전분과 = 엽록체 (ST), M = mitochondrion, N = 핵, V = 액포, 바 = 2μm. B) 이미지가 감염된 잎의 수액에 부정적인 염색법에 의해 감지 된 virions을 보여줍니다.
그림 2. virions의 상대 크기입니다. 길이와 부정적인 착색는 전자 현미경에 나타난 것처럼 감염된 잎의 수액 후 TMV-입자의 폭이 상대적 배포. (길이 / 폭 ± 표준 편차를 의미) 값을 평균 100 virions에서 계산되었다.
Discussion
TEM에 대한 전자 지원 식물 샘플 준비는 몇 시간 3,4,16 내에 신속하고 신뢰할 수있는 ultrastructural 데이터를 제공하기 위해 입증되었습니다. 본 연구에 사용 된 방법으로 달성 세포 소기관과 멤브레인의 미세 구조 보존 샘플 고정의 대규모 감소의 장점과 5,15 기존과 cryofixed 샘플과 비슷했고 약 2 시간에 3 일 이상에서 시간을 삽입. 이것은 문학에서 현재 TEM에 대한 가장 빠른 샘플 준비 프로토콜을 나타냅니다. 본 연구에서 설명하는 방법은 TMV 유발 ultrastructural 변경 및 바이러스 에이전트 자체의 명확하고 신속한 식별 할 수 부정적인 염색 방법과 TEM에 대한 전자 지원 식물 샘플 준비를 결합. TMV 유도 ultrastructural 변경은 전송 elec에 고정의 시작 후 약 4 시간 이내에, 트리밍 sectioning 및 사후 착색 한 후에 조사 할 수TRON 현미경. 완전히 자동으로 표본 준비 모드를 사용하면 바이러스 대리인의 크기와 폭을 결정하기 위해 중간에 제외 착색을 수행 할 연구원을 해제. 따라서, 우리는이 방법은 공장 phytopathology의 농업과 과학 실험 향후 사용하기 위해 매우 중요하다 절반 정도 하루에 식물 바이러스 질환의 명확하고 신속한 진단을 할 수 있다는 결론을 내릴 수 있습니다. 이 방법은 또한 동물과 인간의 질병의 급속한 진단을 위해 사용될 수로 의료 및 수의학 병리의 미래 응용 프로그램에 대한 큰 가능성이 있습니다.
Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 오스트리아 과학 기금 (FWF, P20619 및 BZ에 P22988)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glutaraldehyde | Agar Scientific | R1312 | |
| Osmium tetroxide | Agar Scientific | R1022 | |
| Agar 100 resin | Agar Scientific | R1043 | |
| Dodecenyl succinic anhydride | Agar Scientific | R1051 | |
| Methyl nadic anhydride | Agar Scientific | R1081 | |
| Benzyl dimethylamine | Agar Scientific | R1060 | |
| Lead citrate | Agar Scientific | R1210 | |
| Uranyl acetate | Agar Scientific | R1260A | |
| Phosphotungstic acid | Agar Scientific | R1213 | |
| Formvar | Agar Scientific | R1202 | |
| Leica EM AMW | Leica Microsystems | ||
| Leica (Reichert) Ultratrim | Leica Microsystems | Newer model is available | |
| Leica (Reichert) Ultracut S | Leica Microsystems | Newer model is available | |
| Diatome Ultra 45 | Gröpl | ||
| Philips CM10 TEM | FEI | Newer model is available | |
| Cell D | Olympus Corporation | ||
| Optimas 6.5.1 | Media Cybernetics Inc. | Newer version is available |
References
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