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Biology

Necroscopia diagnostica e selezionati Collezione di tessuti e campioni di ratti e topi

doi: 10.3791/2966 Published: August 7, 2011

Summary

In questo articolo vengono descritte le procedure per lo svolgimento di un esame di base post-mortem di un topo o ratto, e la raccolta di organi di base, così come altri tipi di campioni difficili da per la valutazione istologica, microbiologici e PCR.

Abstract

Ci sono diversi tipi di campioni che possono essere raccolte da un animale eutanasia al fine di diagnosticare o scoprire agenti infettivi in ​​una colonia di animali. Corretta riscossione di tessuti per l'ulteriore elaborazione istologica possono influenzare la qualità dei risultati dei test. Questo articolo descrive il comportamento di un esame di base lorda compresa l'identificazione di cuore, fegato, polmoni, reni e milza, e come raccogliere questi organi. Inoltre quattro dei più difficili del tessuto / campione tecniche di raccolta sono dimostrati. La raccolta e la perfusione polmonare può essere particolarmente impegnativo come il tessuto ha bisogno di essere correttamente gonfiato con un fissatore in modo che all'interno del tessuto per fissare adeguatamente e per consentire approfondita valutazione istologica. Questo articolo illustra passo dopo passo la tecnica per rimuovere il polmone e gonfiare con fissativo al fine di ottenere una fissazione ottimale del tessuto entro 24 ore. Raccolta cervello può essere allo stesso modo impegnativo come il tessuto è morbido e facilmente danneggiabili. Questo articolo illustra passo dopo passo la tecnica per esporre e rimuovere il cervello dal cranio, con minimo danno al tessuto. Il linfonodo mesenterico è un tipo di campione buona in cui per rilevare molti agenti infettivi comuni come virus enterici persistono più a lungo nel linfonodo di quanto non siano nelle feci. Questo articolo illustra la procedura passo-passo per l'individuazione e la rimozione asetticamente il nodo mesenterica linfa. Infine, l'identificazione degli agenti infettivi delle vie respiratorie può essere effettuata da coltura batterica o test PCR di nasale e / o bronchiali dei fluidi aspirati prese a necroscopia. Questa procedura descrive raccogliere ed elaborare i campioni respiratori aspirare per la coltura batterica e test PCR.

Protocol

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1. Preparazione per la necroscopia

  1. Parti importanti di un esame post-mortem lordo (al lordo necroscopico) sono la storia dell'animale e la descrizione dei risultati.
  2. Un patologo veterinario leggendo le diapositive istopatologia potrebbe non aver visto l'animale e conta su di voi per le informazioni di background.
  3. Descrivere esattamente ciò che vedi prima di eutanasia degli animali. Ad esempio, "topo femmina, uno dei cinque nella gabbia; C57BL/6N, testa inclinata verso destra" o "ratto marrone maschile; ceppo sconosciuto; animale si gratta, non vi è perdita di capelli a chiazze sul dorso, vicino alla coda e testa ".
  4. Usa chiaro, descrittivo, linguaggio oggettivo. Modificatori come "lieve", "moderata" e "grave" può essere utile se il cut-off tra i livelli siano chiaramente delimitate. Descrivendo le cose in termini di oggetti prodotti alimentari o per uso domestico non è generalmente raccomandato.
  5. Pesatura e di misurazione degli animali, i risultati, o organi è spesso utile. Un "grande milza" a voi potrebbe essere una milza normale per un altro osservatore. Dire che la milza misure di 3cm x 1,5 centimetri fornisce informazioni più obiettive.
  6. Photodocumentation può essere prezioso.
  7. Osservare tutte sanitari pertinenti sul lavoro e dispositivi di protezione individuale necessari per lavorare con gli animali vivi, carcasse potenzialmente infetti, o sostanze chimiche come formalina.

2. Postmortem posizione lorda e l'esame di cuore, polmoni, fegato, reni e milza

  1. Raccogliere le forniture necessarie prima di eutanasia dell'animale. Come minimo, ciò dovrebbe includere una scheda dissezione o superficie di lavoro simile, pinze, forbici, le etichette per i contenitori, fissativo, ed ogni altro supporto o tubi di raccolta / cups che possono essere potenzialmente necessari.
  2. Brevemente valutare le condizioni, il comportamento e il movimento dell'animale. Osservare e registrare modelli di respirazione (per esempio, rapido, poco profondo), così come la capacità ambulatoriale e l'andatura (ad esempio, zoppicando, girando, tremori).
  3. Eutanasia degli animali secondo le procedure standard presso l'istituto, sempre rispettando le linee guida AVMA.
  4. Valutare le condizioni del corpo dell'animale per anomalie della pelle e pelo, dimagramento, o disidratazione. Prendere nota di eventuali manipolazioni artificiali, protesi, o cicatrici chirurgiche.
  5. Esaminare tutti gli orifizi esterni (orecchie, occhi, naso, ano, aperture genitali, e la cavità orale). L'uso di un ambito dissezione è consigliata per una più stretta osservazione.
  6. Posare il mouse eutanasia o carcassa di ratto in decubito dorsale su una tavola di dissezione pulito o superficie di lavoro simile.
  7. Utilizzando le forbici, incidere la pelle per tutta la lunghezza del ventre dall'ano al mento, riflettendo la pelle e incisione della parete addominale, esponendo il visceri addominali, ghiandole salivari e prepuziale / clitoride e linfonodi cervicali e ascellari. Tagliare la gabbia toracica per esporre ed esaminare i visceri toracici facendo 2 tagli laterali su ogni lato della gabbia toracica, poi uno su, in cima dello sterno, di aprire un ampio spazio sufficiente per esaminare a fondo tutti i lobi dei polmoni.
  8. Esaminare l'aspetto della struttura muscolo-scheletrico.
  9. Valutare tutti gli organi per le anomalie. In particolare trovare e identificare il cuore ei polmoni nella cavità toracica. In particolare trovare e identificare il fegato, reni e milza nella cavità addominale. Segnalare eventuali cambiamenti di colore, differenze di dimensioni, e gli organi mancanti o individuato nella posizione errata. Nota la consistenza delle superfici, qualsiasi tessuto aggiuntivi (ad esempio, masse), tasche fluido, o la presenza di liquido nella cavità addominale / toracico.
  10. Osservare il tratto gastrointestinale per i contenuti, o la mancanza di contenuti, con particolare attenzione per le pareti ispessite, masse, e / o emorragia. Incise i reni (sezione longitudinale sinistra, destra-sezione, sulla linea mediana, ma fuori centro) con una lama di bisturi o un rasoio per verificare parenchima per qualsiasi tipo di anomalia. Controllare il mesentere di linfonodi e / o masse.
  11. Esaminare il sistema urogenitale, alla ricerca di blocchi, tasche fluido, emorragie o altre anomalie.

3. Raccolta post-mortem di cuore, fegato, reni e milza per istopatologia

  1. Raccogliere di dimensioni appropriate, contenitore etichettato (s) riempito con una quantità adeguata del 10% formalina tamponata neutra (NBF). Regolare la quantità del 10% NBF al fine di ottenere un 20:1 rapporto di fissativo al tessuto.
  2. Posizionare il mouse o la carcassa ratto in decubito dorsale su una tavola di dissezione pulito o superficie di lavoro simile ed esporre il tessuto di interesse.
  3. Rimuovere il tessuto dalla carcassa con pinze e forbici.
  4. Tessuto devono essere strettamente tagliata per rimuovere il grasso superfluo e del tessuto connettivo. Tessuto deve essere pulito di sangue, l'uso normale (o fisiologico), soluzione salina) per risciacquare, se necessario. Non usare acqua distillata o di rubinetto per risciacquare i tessuti.
  5. Posizionare il tessuto nel contenitore del 10% NBF.

  1. Raccogliere di dimensioni appropriate, contenitore etichettato (s) riempito con una quantità adeguata del 10% NBF. Regolare il pari al 10% NBF al fine di ottenere un 20:1 rapporto di fissativo al tessuto.
  2. Posizionare il mouse o la carcassa ratto in decubito dorsale su una tavola di dissezione pulito o superficie di lavoro simile.
  3. Esporre la trachea, cuore e polmoni.
  4. Usando forbici e pinze togliere la pelle e il muscolo sovrastante le regioni ventrali toraciche e cervicali.
  5. Usando forbici e pinze, togliere la gabbia toracica di esporre il cuore ei polmoni rendendo 2 tagli laterali su ogni lato della cassa toracica, allora tutto vicino alla clavicola per aprire un ampio spazio sufficiente per esaminare a fondo tutti i lobi dei polmoni.
  6. Tagliare i muscoli del collo si estende dallo sterno e costole alla mandibola, compresi quelli sovrastanti la trachea.
  7. Inserire le forbici sotto il bordo anteriore della gabbia toracica ed effettuare 2 tagli, uno per lato, per rimuovere la sezione di osso sovrastante la trachea.
  8. Afferrare la trachea vicino alla mascella con una pinza e tagliare completamente attraverso la trachea con le forbici posto sopra la pinza
  9. Premete con delicatezza verso l'alto trachea utilizzando il forcipe, snipping connessioni tessuto ventrale con le forbici fino a quando l'intero insieme dei tessuti del torace (trachea, polmoni e cuore, questo è talvolta chiamato il "coraggio") è stato rimosso dal corpo.
  10. Posare i polmoni piatta sul piano di lavoro.
  11. Liberamente legare un pezzo di materiale di sutura o spago da cucina intorno alla trachea facendo attenzione a non tirare.
  12. Riempire una siringa con fissativo e inserire un ago che è abbastanza piccolo da entrare nella trachea. Per i topi, una siringa da 1 ml o 3 ml con un ago 26 gauge funziona bene. Per i ratti, una siringa da 5 ml con una siringa 18 gauge funziona bene.
  13. Inserire l'ago nel foro della trachea e utilizzare pinze per tenere la trachea che circonda l'ago. Iniziare lentamente riempiendo i polmoni con fissativo.
  14. Riempire i polmoni fino a quando completamente gonfio. Non sovra o underinflate. La quantità di fissativo necessario per gonfiare completamente i polmoni varia per età, ceppo, e la salute dell'animale.
    1. Over-inflazione viene rilevato da infiltrazioni di liquidi e la formazione di schiuma dal tessuto polmonare.
    2. Sottogonfiaggio viene rilevata da polmoni appaiono piatti e non completa in tutte le aree.
  15. Rimuovere l'ago dalla trachea.
  16. Stringere il materiale di sutura o la stringa che circonda la trachea per evitare il riflusso di fuori fissativo dei polmoni.
  17. Posizionare i polmoni gonfiati in fissativo utilizzando un approssimativo 20:01 fissativo al rapporto dei tessuti.

5. Raccolta post-mortem del cervello

  1. Raccogliere di dimensioni appropriate, contenitore etichettato (s) riempito con una quantità adeguata del 10% NBF. Regolare il pari al 10% NBF al fine di ottenere un 20:1 rapporto di fissativo al tessuto.
  2. Posizionare il mouse eutanasia o carcassa di ratto in decubito ventrale su una tavola di dissezione pulito o superficie di lavoro simile.
  3. Usando forbici e pinze, togliere la pelle e il muscolo sovrastante il calvaria.
  4. Utilizzando le forbici togliere la testa completamente dalla carcassa.
  5. Utilizzando forbicine inserire la lama in fondo il foro occipitale, l'apertura dove il cranio si apre nel canale spinale, e mantenendo suggerimenti forbice puntato verso l'alto, iniziare a tagliare direttamente e attraverso la linea mediana del calvaria.
  6. Utilizzando pinze, riflettono indietro le due metà del calvaria esponendo il cervello.

    1. Quando possibile, posizionare il cervello esposto in fissativo mentre ancora nel cranio. In questo modo il tessuto di diventare azienda prima della rimozione dal cranio, se questo è richiesto. Patologi molti preferiscono che le sezioni sono tagliati dal cervello mentre ancora nel cranio.

  7. Capovolgere delicatamente il cranio in modo che la gravità aiuteranno il tessuto a cadere dal cranio.
  8. Utilizzando pinze curve, far scorrere con attenzione la pinza lungo il bordo esterno del cervello, e sotto il cervello a partire i lobi olfattivi, che circolano in cervello e verso il cervelletto. Pizzicare delicatamente con le pinze qualsiasi tessuto connettivo o nervi che inibiscono il cervello di cadere dal cranio.
  9. Posizionare il cervello in fissativo con un rapporto approssimativo 20:01 del tessuto di fissativo.

6. Raccolta post-mortem dei linfonodi mesenterici (MLN)

  1. Collezione di tessuti per l'analisi PCR dovrebbe essere fatto utilizzando una tecnica asettica. Fiamma sterilizzati, in autoclave o equivalentemente strumenti sterilizzati devono essere utilizzati.
  2. Assemblare sterili provette Eppendorf e forbici sterili e pinze.
  3. Posizionare il mouse eutanasia o carcassa di ratto in decubito dorsale su una tavola di dissezione pulito o superficie di lavoro simile.
  4. Con forbici e pinze sterilizzate incidere la parete addominale ventrale dalla zona genitale alla base della gabbia toracica, Eliminando la pelle e muscoli e di esporre l'intestino.
  5. Il MLN si trovano nella cavità addominale nel tessuto mesenterico lungo il colon, immediatamente adiacente al cieco.
  6. Per individuare la MLN, in primo luogo individuare il cieco che è il grande, a forma di virgola sezione dell'intestino. I due punti si estende dal cieco e spesso può essere identificato dalla presenza di pellet fecali. Il MLN si trovano nel mesentere lungo il colon adiacente al cieco. Esso può essere identificato come un giallo, grumo ovoidale o sferica piccola parte di tessuto nel tessuto mesenterico bianco ed è spesso leggermente più spessa e più solida nella struttura rispetto al mesentere circostante e grassi. Utilizzare libri di testo di anatomia, se necessario, per l'orientamento.
  7. Usando tecniche asettiche e strumenti sterili rimuovere la MLN e posto in una provetta Eppendorf etichettato con informazioni di identificazione.

7. Raccolta post-mortem di aspirare respiratorie

  1. Montare forniture necessarie - pipetta sterile, forbici e pinze sterili, soluzioni sterili da lavare attraverso le vie respiratorie, e una scheda pulita dissezione o superficie di lavoro simile.
  2. Posare il mouse eutanasia o carcassa di ratto in decubito dorsale sul tavolo di dissezione.
  3. Per aspirato bronchiale nei ratti, l'accesso alle vie respiratorie attraverso la trachea. Per aspirare nasali nei ratti, l'accesso sia attraverso la trachea o attraverso il meato nasofaringeo. Per aspirati nasali o bronchiali nei topi, l'accesso alle vie respiratorie attraverso il meato nasofaringeo.
  4. Se sia aspirati nasali e bronchiali sono necessari, eseguire il aspirato bronchiale prima. Eseguire aspirato nasale con una nuova pipetta sterile.
  5. Accesso tracheale (metodo consigliato per i ratti):
    1. Rispecchiare la pelle di distanza dalla zona cervicale per esporre tessuti sottocutanei.
    2. Rimuovere le ghiandole salivari e muscolatura cervicale per esporre la trachea.
    3. Utilizzando strumenti sterili, incidere la trachea per permettere l'accesso al lume. Mantenere l'asepsi durante la raccolta (Vai al punto 7.7).
  6. Meato accesso nasofaringeo (nasale aspirato e aspirato bronchiale, metodo consigliato per i topi a causa delle dimensioni più piccole della trachea):
    1. Questa procedura può essere eseguita sia per l'aspirazione nasale e aspirato bronchiale.
    2. Utilizzando fiamma sterilizzati in autoclave o strumenti, spezzare il temporomandibolare (mascella) comune e riflettono la mandibola dalla mascella, esponendo il meato nasofaringeo. Mantenere l'asepsi durante la raccolta (Vai al punto 7.7).
  7. Disegna circa 1ml di liquido di campionamento in una pipetta sterile. Questo può essere normale soluzione fisiologica, tampone fosfato, o brodo di soia Trypticase. (Vai al punto 7.8 o 7.9, a seconda di quale aspirare si stanno raccogliendo.)
  8. Aspirato bronchiale:

    1. Asetticamente inserire nella pipetta lume tracheale, diretto caudalmente, e iniettare lentamente il liquido di campionamento nei bronchi e dei polmoni. Prelevare il liquido di campionamento dai bronchi e polmoni nella pipetta e rimuovere la pipetta dalla trachea. Non tutti i fluidi tornerà nella pipetta. Ripetere se più fluido è necessario per il test.

  9. Aspirato nasale:
    1. Asetticamente inserire pipetta nel meato nasofaringeo (topi) o lume tracheale (ratti), diretto cranialmente, e iniettare lentamente il liquido di campionamento nella cavità nasale.
    2. Assicurarsi che la cavità nasale è raggiunto dal contatto del palato nasale con la punta della pipetta, o attraverso l'osservazione di liquido nella cavità costretto, visto come menischi formando al orifizio nasale (narici) o come fluido visibile attraverso il palato traslucido orale. Fluido non deve essere visto uscire attraverso la bocca. Se è così, ri-orientare la pipetta.
    3. Prelevare il liquido di campionamento dalla cavità nasale nella pipetta e rimuovere la pipetta dalla meato o della trachea.
  10. Trasferire asetticamente campione mezzi appropriati o il contenitore per il test.

8. Rappresentante risultati

Figura 1
Figura 1. Addominale e gli organi toracici nel topo. Questi organi sono in genere visibili quando un animale è prima apertura (nessuno degli organi sono stati spostati per esporre anche altri organi presenti nella cavità addominale). A) timo, b) il cuore, c), polmoni, d), diaframma, e), del fegato , f), intestino tenue, g) cieco, h), della vescica urinaria.

Figura 2
Figura 2. Addominale e gli organi retroperitoneali nel topo. Se l'intestino e il fegato sono sollevato e spostato (o rimossa), questi organi can essere visto. a), fegato (per riferimento), b) intestino (per riferimento), c), dello stomaco, d), della milza, e) i reni, f), del colon discendente, g) dell'utero.

Figura 3
Figura 3. Organi riproduttivi maschili. Questi possono essere più grandi in grandi, i maschi sessualmente maturi. A), vescicole seminali e delle ghiandole coagulazione, b) testicolo (spinto nella cavità addominale dallo scroto attraverso gli anelli inguinali, che restano aperti in topi e ratti), c), della vescica urinaria, d) le ghiandole prepuziale, e) epididimo.

Figura 4
Figura 4. Organi riproduttivi femminili. A) non-utero gravido (topi e ratti hanno un utero bicorne), b) ovaio, sepolto in un cuscinetto di grasso ovarico, c), della vescica urinaria, d), le ghiandole del clitoride (analoghe alle ghiandole maschili prepuziale) .

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Discussion

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La raccolta dei dati al termine di uno studio può prescrivere una visita post-mortem degli animali. Descrivono bene ciò che si vede e ricorda di esaminare tutti i tessuti. Queste procedure sono progettati principalmente per ottimizzare l'autopsia e la raccolta dei campioni di sorveglianza delle malattie infettive, ma la maggior parte sono facilmente adattabili alle indagini focalizzate di incidenti sospetto di malattia o epidemie, in cui forse solo un sottoinsieme della procedura possa essere impiegato. Molte delle procedure sono rilevanti anche per autopsie più comunemente eseguiti a conclusione di studi di ricerca come parte di una valutazione complessiva morfologica accoppiato con la raccolta di studi specifici di campioni per successive analisi.

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Disclosures

Gli autori sono tutti i dipendenti del laboratorio di Charles River roditore diagnostica di laboratorio, dove si offrono questi servizi sul mercato.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cutting board Thermo Fisher Scientific, Inc. Cat #36114
Small scissors Roboz Surgical Instruments Co. RS-5910, G204 23mm blades, 3.5" length, straight
Medium scissors Roboz Surgical Instruments Co. RS-6808, G207 5"
Large scissors Roboz Surgical Instruments Co. RS-6826, G65" 6.25"
Forceps-Curved Roboz Surgical Instruments Co. RS-8254 (M1/21004) 4.5", serrated, slight curve
Forceps-Microdissecting Roboz Surgical Instruments Co. RS-5238 Hudson-(EWALD)
Forceps-Tissue Forceps Roboz Surgical Instruments Co. RS--8160 Rat tooth
Flame sterilizer Oxford Labware Bacti-Cinerator #5889-001007
Scalpel Cancer Diagnostics, Inc. Finger Scalpels #60, Cat#FS0060
Pipettes VWR international Pasteur Pipet 5 3/4", Cat#14672-400
Autoclave bags Propper Manufacturing Company Sterilizer Bag Paper Pouches Cat#021002(3100923)E09110 For Pasteur pipettes
Pipette bulb VWR international Cat#56310-240
Eppendorf tubes Sarstedt Ltd SafeSeal microtube 2mL, Ref#72.695
Eppendorf tubes Argos 5mL microtube Cat#T20765-C
Syringe BD Biosciences 1ml-309602 3 ml-300910 5ml-309603 10mL Cat#309604 20mL Cat#309661
Needles BD Biosciences 26G-309625 18G-305195
Neutral buffered formalin VWR international 20L 10% NBF, Cat#16004-128
Saline Thermo Fisher Scientific, Inc. Buffered Blood Bank Saline, Cat#23-309-178
Trypticase soy broth BD Biosciences TSB: Dehydrated, Cat#211825
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich HA Buffer, Cat#P3813-10PAK
Formalin cups VWR international 4oz Cat#36318-852 8oz Cat#36318-860 16oz Cat#36318-858
Large formalin cups OakRidge Products 32oz container Cat#0432-1100
Extra large formalin cup VWR international HDPE Multipurpose 160oz container Cat#89038-282
Suture material Henry Schein Braided silk surgical suture, Ref#100-5000, M766750 For mouse lung inflation
Twine Staples Cat#QUA-46173 For rat lung inflation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. AVMA. AVMA Guidelines on Euthanasia. (2007).
  2. Feldman, D. B., Seely, J. C. Necropsy Guide: Rodents and the rabbit. CRC Press. (1988).
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  6. Morawietz, G. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--Part 3. A joint publication of the RITA and NACAD groups. Exp Toxicol Pathol. 55, 433-449 (2004).
  7. Popesko, P., Raijtová, V., Horák, J. Colour Atlas of Anatomy of Small Laboratory Animals. 2, 1st edn, Saunders. vol. 2: Rat, mouse, hamster 91-106 (2002).
  8. Ruehl-Fehlert, C. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55, 91-106 (2003).
Necroscopia diagnostica e selezionati Collezione di tessuti e campioni di ratti e topi
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Cite this Article

Parkinson, C. M., O'Brien, A., Albers, T. M., Simon, M. A., Clifford, C. B., Pritchett-Corning, K. R. Diagnostic Necropsy and Selected Tissue and Sample Collection in Rats and Mice. J. Vis. Exp. (54), e2966, doi:10.3791/2966 (2011).More

Parkinson, C. M., O'Brien, A., Albers, T. M., Simon, M. A., Clifford, C. B., Pritchett-Corning, K. R. Diagnostic Necropsy and Selected Tissue and Sample Collection in Rats and Mice. J. Vis. Exp. (54), e2966, doi:10.3791/2966 (2011).

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