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Biology

진단 검시와 고양이와 마우스의 선택 조직 및 샘플 수집

doi: 10.3791/2966 Published: August 7, 2011

Summary

이 문서에서는 마우 스나 암흑의 기본적인 사후 심사를 실시를위한 절차 및 기본적인 장기의 수집뿐만 아니라, histological 미생물 및 PCR 평가에서 더 많은 도전 샘플 유형을 설명합니다.

Abstract

동물 식민지에 전염성이 에이전트를 진단하거나 찾을 수 있도록 도와 위해서는 euthanized 동물에서 수집될 수 있습니다 여러 샘플 종류가 있습니다. 자세한 histological 처리를위한 조직의 적절한 컬렉션 시험 결과의 품질에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 문서는 마음의 식별, 간, 폐, 신장, 그리고 비장뿐만 아니라, 어떻게 그 장기를 수집하는 포함하는 기본적인 총 시험의 행위에 대해 설명합니다. 더 어려운 조직 / 샘플 수집 기법 또한 네이 증명하고 있습니다. 조직이 제대로 올바르게 수정하고 철저한 histologic 평가를 활성화하기 위해 조직의 내부 위해서 정착액로 증가 필요로 폐 수집 및 재관류 특히 도전하실 수 있습니다. 이 문서는 24 시간 이내에 조직의 최적의 고정을 달성하기 위하여 정착액으로 폐를 제거하고 그것을 팽창 단계 기술에 의해 단계를 보여줍니다. 조직이 부드럽고 쉽게 손상으로 두뇌 컬렉션 비슷하게 도전하실 수 있습니다. 이 문서에서는 조직에 최소한의 손상과 두개골의 두뇌를 폭로하고 제거하는 단계 기술에 의해 단계를 보여줍니다. mesenteric 림프절은 장용 바이러스가 그들이 배설물에 헛간보다 림프절에 이상 계속 많은 일반적인 전염성 요원을 감지할 수있는 좋은 예제 유형입니다. 이 문서 위치하고 무균 mesenteric 림프절을 제거하는 단계 절차에 의해 단계를 보여줍니다. 마지막으로, 호흡기의 감염 대리인의 신분은 세균성 문화 또는 비강 및 / 또는 기관지 유체가 검시에서 찍은 aspirates의 PCR 검사에 의해 수행할 수 있습니다. 이 절차를 취득하고 박테리아 문화와 PCR 검사에 대한 호흡기 대기음 샘플 준비에 대해 설명합니다.

Protocol

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1. 검시 준비

  1. 어떤 총 사후 심사 (총 검시)의 중요한 부분은 동물의 역사와 결과의 설명입니다.
  2. 귀하의 조직 병리학 슬라이드를 읽는 수의학 병리학자는 동물을 본적이 없을 수 있으며 배경 정보에 대해에 의존합니다.
  3. 정확하게 당신이 동물을 안락사 전에 뭐가 보이는지 설명해주십시오. 예를 들어, "여성 마우스, 새장에서 다섯 중 하나, C57BL/6N, 머리를 오른쪽으로 기울어져"또는 "갈색 남성 쥐, 변형 알 수없는, 꼬리 근처 dorsum에 누덕누덕 기운 탈모가 있으며, 동물 긁적이다 머리 ".
  4. 명확하고 설명하는 객관적 언어를 사용합니다. 레벨 사이의 단절이 명확 demarcated하는 경우에는 "중간", "온화"및 "심각한"로 조절이 유용할 수 있습니다. 음식이나 가정용 개체의 관점에서 기술한 것들은 일반적으로 권장하지 않습니다.
  5. 동물, 결과, 또는 장기 무게 및 측정하는 것은 종종 유용합니다. 당신에게 '큰 비장 "는 또 다른 관찰자로 정상적인 비장 수 있습니다. 비장은 3cm X 1.5cm보다 객관적인 정보를 제공 측정한다는.
  6. Photodocumentation은 매우 가치 수 있습니다.
  7. 모든 관련 산업 보건 및 살아있는 동물, 잠재적으로 전염성 시체, 또는 포르말린과 같은 화학 물질 작업에 필요한 개인 보호 장비를 관찰.

2. 총 사후 위치와 심장 검사, 폐, 간, 신장, 그리고 비장

  1. 이전에 동물의 안락사에 필요한 물품을 수집합니다. 최소한, 이것은 해부 보드 또는 이와 유사한 작업 표면, 집게, 가위, 용기 라벨, 정착액, 및 미디어 또는 수집 튜브 / 가능성이 필요할 수도 컵을 포함해야합니다.
  2. 간단히 조건, 행동, 그리고 동물의 움직임을 평가합니다. 호흡 패턴 (예, 급속한, 얕은)뿐만 아니라 외래 능력과 보행 (예, 돌고, 떨림을 절뚝거리는) 관찰하고 기록합니다.
  3. 항상 AVMA 지침을 준수하여 기관에서 표준 절차에 따라 동물을 안락사.
  4. 피부와 외투 이상, 여윔, 또는 탈수에 대한 동물의 신체 조건을 평가합니다. 어떤 인공 조작, 이식, 또는 흉터 수술을 기록해 둡니다.
  5. 모든 외부 orifices을 (귀, 눈, 코, 항문, 성기 구멍 및 구강) 확인합니다. 해부 범위의 사용은 가까이 관찰하는 것이 좋습니다.
  6. 깨끗한 절개 보드 또는 이와 유사한 작업 표면에 지느러미 드러누움에 euthanized 마우스 또는 쥐 시체를 놓는다.
  7. 가위를 사용하여, 피부를 반영하고 복벽을 절개, 복부 내장, 타액 및 clitoral / preputial 분비하고, 자궁 경부 및 겨드랑 림프절을 노출, 턱로 항문에서 피부에게 ventrum의 전체 길이를 절개. 폐의 모든​​ 엽 (叶)을 철저하게 조사하는 정도로 넓은 공간을 열려면, 가슴의 상단에 2 옆으로 ribcage의 각 측면까지 상처 후, 전체를하여 흉부 내장을 폭로하고 조사에 갈빗대 컷.
  8. musculoskeletal 구조의 모양을 검사합니다.
  9. 이상의 모든 기관을 평가해보십시오. 특히 발견과 흉강의 심장과 폐를 확인합니다. 특히 발견과 복강의 간, 신장 및 비장을 식별합니다. 어떤 색상 변경, 크기의 차이, 그리고 없거나 mislocated 장기 있습니다. 표면의 일관성, 추가 조직 (예, 대중), 유체 주머니, 또는 복부 / 흉부 충치에 유체의 존재를합니다.
  10. 걸쭉하게 벽, 군중, 및 / 또는 출혈에 대한 특별한주의를 기울이고, 위장병 내용에 대해 트랙트, 또는 내용의 부족을 관찰. 모든 비정상에 대한 실질을 확인 메스 또는 레이저 블레이드와 신장을 (정중선에서 왼쪽 세로 섹션을 마우스 오른쪽 단면,하지만 중심을 벗어난) 절개. 확대 림프절 및 / 또는 대중에 대한 장간막을 확인합니다.
  11. 막혀, 유체 주머니, 출혈 또는 다른 이상을 찾고, urogenital 시스템을 검사합니다.

3. 심장, 간, 신장, 그리고 조직 병리학을위한 비장의 사후 모음

  1. (NBF) 포르말린 버퍼, 중립 10 % 적당한 양의 가득 표시된 용기 (들)을 적절하게 크기 모아라. 조직 정착액의 20시 1분 비율을 얻기 위해서는 10 % NBF의 양을 조정합니다.
  2. 깨끗한 절개 보드 또는 이와 유사한 작업 표면에 지느러미 드러누움에서 마우스 또는 쥐의 시체를 놓고 관심의 조직을 쉽게받을 수 있습니다.
  3. 포셉 및 가위를 사용하여 시체에서 조직을 제거합니다.
  4. 조직은 밀접하게 지방과 불필요한 결합 조직을 제거하는 손질되어야합니다. 조직의 피를 깨끗하게한다; 필요한 린스 (또는 physiologic) 호수) 정상적인 사용합니다. 조직을 린스로 증류수 또는 수돗물 물을 사용하지 마십시오.
  5. 10 % NBF의 컨테이너에 조직을 놓으십시오.

  1. , 10 % NBF의 적당한 금액으로 가득 표시된 용기 (들)을 적절하게 크기 모아라. 조직 정착액의 20시 1분 비율을 얻기 위해서는 10 % NBF의 금액을 조정합니다.
  2. 깨끗한 절개 보드 또는 이와 유사한 작업 표면에 지느러미 드러누움에서 마우스 또는 쥐의 시체를 놓습니다.
  3. 기관, 심장, 폐 및 노출.
  4. 가위와 집게를 사용하면 복부 흉부와 경추 지역 overlying 피부와 근육을 제거하십시오.
  5. 가위와 집게를 사용하여 폐의 모든​​ 엽 (叶)을 철저하게 조사하는 정도로 넓은 공간을 열고 2 옆으로 ribcage의 각 측면까지 상처 후, 쇄골 근처에 걸쳐 하나를하여 심장과 폐를 노출 ribcage를 제거합니다.
  6. 기관을 overlying 포함, 흉골과 갈비뼈에서 턱에 걸친 목 근육을 버려야.
  7. 흉곽의 앞쪽에 가장자리 아래에 가위를 삽입하고기도를 overlying 뼈의 섹션을 제거 2 인하, 양쪽에 하나를합니다.
  8. 포셉과 턱 근처의 기관을 파악하고 포셉 위의 위치 가위로 기관을 통해 완전히 절단
  9. 부드럽게 가슴 조직의 전체 집합까지 가위로 복부 조직 연결을 snipping, 포셉를 사용하여 기관의 위쪽 더그 (기관, 폐, 심장, 이것은 때로는 "뽑은"라고 함) 신체에서 제거되었습니다.
  10. 작업 표면에 폐가 평평하다.
  11. 대충 꽉 끌어 안 돌보는 기관 주위 봉합 재료 또는 주방 트와인 조각을 묶어.
  12. 정착액과 주사기를 입력하고기도를 입력 정도로 작은 바늘을 연결합니다. 마우스 들어, 26 게이지 바늘로 1ml 또는 3ml 주사기가 잘 작동합니다. 쥐 들어, 18 게이지 주사기와 주사기 5ml 잘 작동합니다.
  13. 기관의 개통에 바늘을 삽입하고 바늘을 둘러싼기도를 잡아 집게를 사용합니다. 천천히 정착액과 폐가 작성 시작합니다.
  14. 완전히 팽창한까지 폐가 채우십시오. 이상 또는 underinflate하지 마십시오. 완전히 폐가 팽창에 필요한 정착액의 양은 나이, 변형, 그리고 동물의 건강에 따라 달라집니다.
    1. 이상 - 인플레이션이 들어와서 및 폐 조직에서 거품 유체에 의해 감지됩니다.
    2. Underinflation은 모든 분야에서 평면 및 전체 나타나지 폐에 의해 감지됩니다.
  15. 기관에서 바늘을 제거합니다.
  16. 봉합 재료 또는 폐 정착액 밖으로의 역류를 방지하기 위해 기관을 둘러싼 문자열을 조인다.
  17. 조직 비율 대략 20시 1분 정착액을 사용 정착액에 부풀 폐를 놓습니다.

5. 두뇌의 사후 모음

  1. , 10 % NBF의 적당한 금액으로 가득 표시된 용기 (들)을 적절하게 크기 모아라. 조직 정착액의 20시 1분 비율을 얻기 위해서는 10 % NBF의 금액을 조정합니다.
  2. 깨끗한 절개 보드 또는 이와 유사한 작업 표면에 복부 드러누움에 euthanized 마우스 또는 쥐 시체를 놓습니다.
  3. 가위와 집게를 사용하여 calvaria을 overlying 피부와 근육을 제거하십시오.
  4. 가위를 사용하면 시체에서 완전히 머리를 제거합니다.
  5. 구멍의 매그넘, 두개골은 척추 운하에 열리는 오프닝에 하단에 칼날 삽입 작은 가위를 사용하고, 유지 가위 도움말을 위쪽으로 향하고, 직접 위로와 calvaria의 정중선을 통해 절단 시작합니다.
  6. 포셉를 사용하여 뇌를 노출 calvaria의 두 반쪽을 다시 반영합니다.

    1. 가능한 경우, 두개골에있는 동안 아직 정착액에 노출된 머리를 놓으십시오. 이것은 이것이 필요한 경우 조직은 이전 두개골에서 제거하기 위해 회사가 될 수 있습니다. 많은 병리학자는 부분은 두개골에있는 동안 계속 머리에서 절단하는 선호합니다.

  7. 그 중력이 조직은 두개골에서 가을에하는 데 도움이되도록 부드럽게 두개골을 반전.
  8. 곡선 집게를 사용하여 조심스럽게 뇌를 아래와 소뇌쪽으로 이동, 뇌의 외부 가장자리와 후각 엽 (叶)에서 시작 두뇌에서 집게를 슬라이드. 부드럽게 두개골에서 떨어지는에서 머리를 억제 포셉 모든 결합 조직이나 신경이 함께 핀치.
  9. 정착액에 조직의 대략적인 20시 1분 비율을 사용하여 정착액에 두뇌를 놓습니다.

6. mesenteric 림프절 (MLN)의 사후에 수집

  1. PCR 분석을위한 조직 컬렉션 무균 기술을 사용하여 완료해야합니다. 불꽃, 소독 autoclaved 또는 equivalently 소독 악기를 사용해야합니다.
  2. 무균 Eppendorf 튜브 및 멸균 가위와 집게를 조립.
  3. 깨끗한 절개 보드 또는 이와 유사한 작업 표면에 지느러미 드러누움에 euthanized 마우스 또는 쥐 시체를 놓습니다.
  4. 소독 가위와 집게를 사용하면 성기 영역에서 ribcage의 기본으로 복부 복벽을 절개, 피부와 근육을 모두 제거하고 내장을 알아가는 겁니다.
  5. MLN은이게 맹장 바로 인접한 콜론 따라 mesenteric 조직의 복강에 위치하고 있습니다.
  6. MLN을 찾으려면 먼저 대장의 대형 쉼표 모양의 섹션입니다이게 맹장을 찾습니다. 콜론은이게 맹장에서 확장하고 그것은 종종 배설물 쥐똥의 존재에 의해 확인할 수 있습니다. MLN는 맹장에 인접한 콜론 함께 장간막에 위치하고 있습니다. 이것은 흰색 mesenteric 조직에서 조직의 황색, 난형 또는 구형 작은 덩어​​리로 식별하고 종종 주변 장간막 지방보다 질감에서 약간 두껍하고 firmer 수있다. 오리 엔테이션에 필요한 해부학 교과서를 사용합니다.
  7. 무균 기술과 멸균 악기를 사용하면 식별 정보를 표시 Eppendorf 튜브에 MLN과 장소를 제거합니다.

7. 호흡 대기음의 사후 모음

  1. 필요한 물품을 조립 - 멸균 피펫, 멸균 가위와 집게, 호흡기를 통해 플러시하는 살균 솔루션, 깨끗한 해부 보드 또는 이와 유사한 작업 표면을.
  2. 해부 보드 등의 드러누움에 euthanized 마우스 또는 쥐 시체를 놓는다.
  3. 쥐에서 기관지 대기음은기도의 방법에 의해 호흡기에 액세스할 수 있습니다. 기관이나 nasopharyngeal (外耳道)를 통해서 쥐, 액세스의 코뼈 대기음하십시오. 생쥐의 기관지 또는 비강 aspirates 들어, nasopharyngeal (外耳道)를 통해 호흡기에 액세스할 수 있습니다.
  4. 비강 및 기관지 모두 aspirates이 필요한 경우, 먼저 기관지 대기음을 수행합니다. 새로운 멸균 피펫을 사용하여 코뼈 대기음을 수행합니다.
  5. Tracheal 액세스 (쥐 권장 방법) :
    1. 멀리 피하 조직을 노출하기 위해 자궁 경부 지역에서 피부를 반영합니다.
    2. 침샘과 기관을 폭로 자궁 근육을 제거합니다.
    3. 무균 악기를 사용하여, 루멘에 대한 액세스를 허용하는 기관을 절개. 컬렉션 전체에서 무균을 (단계 7.7로 이동합니다) 유지.
  6. Nasopharyngeal (外耳道) 액세스 (비강 기음과 기관지 기음, 기관의 작은 크기로 인해 쥐를위한 권장 방법) :
    1. 이 절차는 비강의 기음과 기관지 대기음 모두 수행할 수 있습니다.
    2. 불꽃 - 멸균 또는 악기를 autoclaved를 사용하면, 공동 temporomandibular을 (턱) 끊다 멀리 maxilla에서 mandible을 반영, nasopharyngeal (外耳道)을 알아가는 겁니다. 컬렉션 전체에서 무균을 (단계 7.7로 이동합니다) 유지.
  7. 멸균 피펫으로 샘플링 유체의 약 1ml 그립니다. 이것은 정상적인 생리 수도 인산염은 염분 버퍼링 또는 trypticase의 간장 국물. (당신이 수집하는 대기음에 따라 7.8 또는 7.9 단계로 이동합니다.)
  8. 기관지 대기음 :

    1. 무균 caudally 감독, tracheal 루멘에 피펫을 삽입하고, 천천히 기관지와 폐로 샘플링 액체를 주입. 피펫으로 기관지와 폐에서 샘플링 유체를 철회하고 기관에서 피펫을 제거하십시오. 모든 유체의는 피펫으로 돌아갑니다. 더 많은 액체가 테스트를 위해 필요한 경우 반복합니다.

  9. 비강 대기음 :
    1. 무균 nasopharyngeal (外耳道) (마우스) 또는 cranially 감독 tracheal 루멘 (쥐)에 피펫을 삽입하고, 천천히 비강에 샘플링 액체를 주입.
    2. 비강이 피펫 팁과 함께, 또는 비강 오리피스 (나레스) 또는 반투명 구두 미각을 통해 보이는 유체로 menisci 형성으로 본 캐비티로 강제 유동의 관찰에 의해 비강 미각의 접촉에 의해 도달되었는지 확인하십시오. 유체는 입을 통해 종료 볼 수 없습니다. 그렇다면, 다시 방향 피펫.
    3. 피펫으로 비강에서 샘플링 유체를 철회하고 (外耳道) 또는 기관에서 피펫을 제거하십시오.
  10. 무균 시험에 적합 미디어 또는 컨테이너에 샘플을 전송할 수 있습니다.

8. 대표 결과

그림 1
그림 1. 마우스의 복부와 흉부 기관. 이들 기관은 동물이 처음 (장기 아무도이 복강도 현재 다른 장기 노출로 이동되지 않았습니다)을 열 때 일반적으로 볼 수 있습니다.) thymus, B) 심장, C)은 폐, D) 다이어프램, 전자) 간 , F) 작은 창자, G) -이게 맹장, H)의 오줌 방광.

그림 2
그림 2. 마우스의 복부와 retroperitoneal 기관. 창자와 간장을 해제하고 (또는 제거)로 이동하는 경우,이 기관 CA콜론 내림차순 N 볼 수 있습니다.) 간 (참조), B) 장내 (참조), C) 위, D) 비장, 전자) 신장, F), G) 자궁.

그림 3
그림 3. 남성의 생식 기관. 이들은 큰, 성적으로 성숙한 남성으로 큰 수 있습니다.) 정액 vesicles과 coagulating 땀샘, B) testis (마우스 및 쥐에서 열린 남아 사타구니 고리를 통해 음낭에서 복강으로 밀고), C) 오줌의 방광, D) preputial 땀샘, 전자) epididymis.

그림 4
그림 4. 여성 생식 기관.) 비 gravid 자궁 (마우스 및 쥐가 bicornuate 자궁을 가지고) B) 난소 지방 패드, C에 묻혀 난소) 방광, D) clitoral 분비 (남성 preputial 분비하는 유사) .

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Discussion

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연구의 끝에 데이터 컬렉션은 동물의 사후 검사가 필요할 수 있습니다. 본 어떤 잘 설명하고 모든 조직을 검사해야합니다. 이러한 절차는 감염증 감시에 대한 검시 및 샘플 수집을 최적화하기 위해 주로 설계 있지만 대부분 쉽게 절차의 아마 단지 일부가 고용 것입있는 의심 질병이나 사고 발생의 집중 조사에 적응하고 있습니다. 절차의 대부분은 또한 더 일반적으로 후속 분석을 위해 공부 특정 샘플의 수집과 함께 전반적인 형태학의 평가의 일환으로 조사 연구의 결론에서 수행 necropsies과 관련이 있습니다.

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Disclosures

저자는 이러한 서비스가 상업적으로 제공 찰스 리버의 연구실 설치류 진단 실험실의 모든 직원입니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cutting board Thermo Fisher Scientific, Inc. Cat #36114
Small scissors Roboz Surgical Instruments Co. RS-5910, G204 23mm blades, 3.5" length, straight
Medium scissors Roboz Surgical Instruments Co. RS-6808, G207 5"
Large scissors Roboz Surgical Instruments Co. RS-6826, G65" 6.25"
Forceps-Curved Roboz Surgical Instruments Co. RS-8254 (M1/21004) 4.5", serrated, slight curve
Forceps-Microdissecting Roboz Surgical Instruments Co. RS-5238 Hudson-(EWALD)
Forceps-Tissue Forceps Roboz Surgical Instruments Co. RS--8160 Rat tooth
Flame sterilizer Oxford Labware Bacti-Cinerator #5889-001007
Scalpel Cancer Diagnostics, Inc. Finger Scalpels #60, Cat#FS0060
Pipettes VWR international Pasteur Pipet 5 3/4", Cat#14672-400
Autoclave bags Propper Manufacturing Company Sterilizer Bag Paper Pouches Cat#021002(3100923)E09110 For Pasteur pipettes
Pipette bulb VWR international Cat#56310-240
Eppendorf tubes Sarstedt Ltd SafeSeal microtube 2mL, Ref#72.695
Eppendorf tubes Argos 5mL microtube Cat#T20765-C
Syringe BD Biosciences 1ml-309602 3 ml-300910 5ml-309603 10mL Cat#309604 20mL Cat#309661
Needles BD Biosciences 26G-309625 18G-305195
Neutral buffered formalin VWR international 20L 10% NBF, Cat#16004-128
Saline Thermo Fisher Scientific, Inc. Buffered Blood Bank Saline, Cat#23-309-178
Trypticase soy broth BD Biosciences TSB: Dehydrated, Cat#211825
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich HA Buffer, Cat#P3813-10PAK
Formalin cups VWR international 4oz Cat#36318-852 8oz Cat#36318-860 16oz Cat#36318-858
Large formalin cups OakRidge Products 32oz container Cat#0432-1100
Extra large formalin cup VWR international HDPE Multipurpose 160oz container Cat#89038-282
Suture material Henry Schein Braided silk surgical suture, Ref#100-5000, M766750 For mouse lung inflation
Twine Staples Cat#QUA-46173 For rat lung inflation

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References

  1. AVMA. AVMA Guidelines on Euthanasia. (2007).
  2. Feldman, D. B., Seely, J. C. Necropsy Guide: Rodents and the rabbit. CRC Press. (1988).
  3. King, J. M., Dodd, D. C., Roth, L. The Necropsy Book. 4th edn, C.L. Davis Foundation. (2006).
  4. Kittel, B. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--Part 2. A joint publication of the RITA and NACAD groups. Exp Toxicol Pathol. 55, 413-431 (2004).
  5. Fox, J. G. Chapter 1. The Mouse in Biomedical Research. Elsevier. Vol. 3: Normative biology, husbandry, and models 1-22 (2007).
  6. Morawietz, G. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--Part 3. A joint publication of the RITA and NACAD groups. Exp Toxicol Pathol. 55, 433-449 (2004).
  7. Popesko, P., Raijtová, V., Horák, J. Colour Atlas of Anatomy of Small Laboratory Animals. 2, 1st edn, Saunders. vol. 2: Rat, mouse, hamster 91-106 (2002).
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Cite this Article

Parkinson, C. M., O'Brien, A., Albers, T. M., Simon, M. A., Clifford, C. B., Pritchett-Corning, K. R. Diagnostic Necropsy and Selected Tissue and Sample Collection in Rats and Mice. J. Vis. Exp. (54), e2966, doi:10.3791/2966 (2011).More

Parkinson, C. M., O'Brien, A., Albers, T. M., Simon, M. A., Clifford, C. B., Pritchett-Corning, K. R. Diagnostic Necropsy and Selected Tissue and Sample Collection in Rats and Mice. J. Vis. Exp. (54), e2966, doi:10.3791/2966 (2011).

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