מאמר זה מתאר שיטה להשיג תלת ממדי (3D) מבנה של מולקולות התאספו helically באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים cryo-. בפרוטוקול זה, אנו משתמשים אסיפות HIV-1 capsid כדי להמחיש את הליך שחזור מפורט 3D להשגת מפת צפיפות לפי שיטת איטרטיבי אמת בחלל הסליל מחדש.
במיקרוסקופ אלקטרונים cryo-(cryo-EM), בשילוב עם עיבוד תמונה, היא כלי רב עוצמה יותר ויותר להגדרה של מבנה חלבון מתחמי macromolecular והרכבות. למעשה, חלקיק יחיד מיקרוסקופית אלקטרונים 1 ו דו ממדי (2D) קריסטלוגרפיה אלקטרון 2 הפכו מתודולוגיות שגרתי יחסית מספר גדול של מבנים נפתרו באמצעות שיטות אלה. במקביל, עיבוד תמונה תלת מימדי (3D) שחזור של אובייקטים הסליל התפתחה במהירות, בעיקר, איטרטיבי הסליל מרחב אמת שחזור (IHRSR) שיטה 3, אשר משתמשת יחיד כלי ניתוח החלקיקים בשיתוף עם סימטריה הסליל. גורמים ביולוגיים רבים לתפקד בצורות פילמנטיות או הסליל, ובהם סיבי אקטין 4, 5 microtubules, סיבי עמילואיד 6, 7 פסיפס טבק וירוסים, חיידקים שוטונים 8, וכן, כי מפת צפיפות 3D של ישות הסליל ניתן להשיג מ – הקרנה אחת התמונה, לעומת תמונות רבות נדרש שחזור 3D של אובייקט שאינו הסליל, עם שיטת IHRSR, ניתוח מבניות של אסיפות כאלה הסליל גמישה סדר היום השגה.
במאמר זה וידאו, אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים לקבלת מפת צפיפות 3D של הרכבה חלבון הסליל (HIV-1 הוא capsid 9 בדוגמה שלנו), כולל פרוטוקולים להכנת cryo-EM הדגימה, איסוף נתונים על ידי מינון נמוך cryo-EM, אינדוקס דפוסי עקיפה הסליל, ועיבוד תמונה ושיקום באמצעות 3D IHRSR. לעומת טכניקות אחרות, cryo-EM מציע לשימור הדגימה האופטימלי בתנאים יליד הקרוב. דוגמאות המוטבעות בשכבה דקה של קרח זגוגי, על ידי הקפאה מהירה, צילמו ב המיקרוסקופים האלקטרונים בטמפרטורת חנקן נוזלי, בתנאים במינון נמוך כדי למזער את נזק הקרינה. תמונות לדוגמה מתקבלים בתנאים יליד ליד על חשבון אות נמוך ניגודיות נמוכה ב micrographs מוקלט. למרבה המזל, בתהליך של שיקום הסליל יש במידה רבה אוטומטיות, למעט לאינדקס דפוס עקיפה הסליל. כאן אנו מתארים גישה מבנה הסליל מדד ולקבוע הסימטריות הסליל (הסליל פרמטרים) מתוך micrographs דיגיטציה, צעד חיוני עבור 3D הסליל מחדש. בקצרה, אנו מקבלים המפה הראשונית צפיפות 3D באמצעות יישום שיטת IHRSR. מפה זו היא ראשונית ולאחר מכן מזוקק iteratively ידי החדרת אילוצים עבור הפרמטרים יישור של כל פלח, ובכך השליטה שלהם מעלות של חופש. שיפור נוסף מושג על ידי תיקון לתפקוד לעומת העברה (CTF) של מיקרוסקופ אלקטרונים (תיקון המשרעת והפאזה) וכן על ידי אופטימיזציה של סימטריה הסליל של האסיפה.
אנו מציגים קבוצה של פרוטוקולים כדי לספק גישה פשוטה להשיג מבנים 3D של אובייקטים הסליל. שימוש בהליכים שתוארו, רכשנו מבנה 3D של הרכבה-HIV-1 capsid מהתמונה צינור יחיד (176 חלקים). מבנים ברזולוציה גבוהה יכולה להיות מושגת על ידי הכללת נתוני התמונה יותר.
ישנן כמה נקודות קריטיות עבור איסוף נתונים ניתוח אופטימלית: ראשית, במהלך הכנת הדגימה cryo-EM, הפתרון צריך להיות מדגם מחק משם, משאיר שכבה אחידה, דקה של הפתרון הזה הוא מעט עבה יותר גודל המדגם. ישנן דרכים שונות למחוק את המדגם. עבור תאים חיידקיים דגימות צינורי, כגון HIV-1 CA הרכבה, סופג מצד אחד, במיוחד בצד הגב, הוא המתאים ביותר.
שנית, handedness של הסליל צריך להיות נחוש, כמו זה לא יכול להיעשות על ידי אינדקס שחזור או הסליל. מנהג נפוץ הוא להשתמש להקפיא תחריט, ואחריו רוטרי הצללה 18 כדי לקבוע handedness. Handedness ניתן גם נקבע שלאחר השחזור כאשר הרזולוציה של המפה צפיפות גבוהה מספיק; הדגמים אטומי 3D של רכיבים בודדים צריכה להתאים היטב במפת צפיפות כאשר handedness נכונה ההנחה. אחרת, handedness ההפך יש להניח.
שלישית, מסנן וינר אמור לשמש במהלך עיבוד תמונה, לשלב והן תיקון משרעת, כדי להפחית את רעש הגברה. מאז CTF מתוך תמונה אחת תמיד יש אפס המעברים, חלק מן המידע בחלל הגומלין הולך לאיבוד. לכן, זה הכרחי כדי לקבל נתונים הקרנה מרובות קובע כלל עבור 3D שיקום, כל הדמיה בערכים defocus שונים.
The authors have nothing to disclose.
המחברים מבקשים להודות לד"ר Gongpu ג'או Danxia Ke לקבלת תמיכה טכנית. אנו מודים בני הזוג. אדוארד Egelman וניקו Grigorieff לשיתוף תוכנת עיבוד התמונה שלהם. אנחנו גם מכירים את הצוות התומכים לביולוגיה מבנית cryo-EM מתקן אשכול Beowulf ורשת באוניברסיטת פיטסבורג הספר לרפואה. עבודה זו נתמכה על ידי GM082251 ו GM085043.
Name | Source | Comments |
Glow-discharge device 100X | Glow-discharge device 100X | |
Tecnai Polara F30 microscope with a Field Emission Gun | FEI, Hillsboro, OR | |
Gatan 4K x 4K CCD camera | Gatan, Pleasanton, CA | |
Plunge-freezing device | Home-made manual gravity plunger | |
Quantifoil R2/1 200 mesh holely-carbon copper grids | Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany | |
EM software EMAN | http://blake.bcm.edu/EMAN/ | |
EM software IHRSR | http://people.virginia.edu/~ehe2n/ | Programs available from Edward H. Egelman |
EM software Spider | http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html | |
MRC based helical processing software | http://www.riken.jp/biostrmech/index.html | Programs available from Koji Yonekura |
CTFFIND3/CTFTILT and Real-space helical refinement software | http://emlab.rose2.brandeis.edu/software |