Summary
Este artículo describe un método para obtener una imagen tridimensional (3D), estructura de las moléculas helicoidales ensamblados con crio-microscopía electrónica. En este protocolo, el uso de conjuntos de la cápside del VIH-1 para ilustrar el procedimiento detallado de reconstrucción 3D para el logro de un mapa de densidad por el método iterativo helicoidal reconstrucción del espacio real.
Abstract
Crio-microscopía electrónica (crio-ME), en combinación con el procesamiento de imágenes, es una herramienta cada vez más potentes para la determinación estructural de complejos de proteínas macromoleculares y asambleas. De hecho, la microscopía electrónica de partículas solo una y dos dimensiones (2D) cristalografía de electrones se han convertido en dos metodologías relativamente de rutina y un gran número de estructuras se han solucionado con estos métodos. Al mismo tiempo, procesamiento de imágenes y de tres dimensiones (3D) la reconstrucción de los objetos helicoidales se ha desarrollado rápidamente, sobre todo, el proceso iterativo helicoidal real espacio de reconstrucción (IHRSR) Método 3, que utiliza solo las herramientas de análisis de partículas en conjunción con simetría helicoidal. Muchas entidades de función biológica en formas filamentosas o helicoidal, como los filamentos de actina 4, 5 microtúbulos, las fibras amiloides 6, virus del mosaico del tabaco 7, 8 y flagelos bacterias, y, debido a un mapa de densidad 3D de una entidad helicoidal se puede lograr a partir de una sola proyección la imagen, en comparación con la gran cantidad de imágenes necesarios para la reconstrucción 3D de un objeto no helicoidal, con el método IHRSR, el análisis estructural de tales asambleas helicoidal flexible y desordenada es ahora una meta alcanzable.
En este artículo de vídeo, que proporciona protocolos detallados para la obtención de un mapa de densidad 3D de un conjunto de proteínas helicoidales (VIH-1 cápside 9 es nuestro ejemplo), incluyendo protocolos para la preparación de muestras crio-ME, dosis bajas de recolección de datos de la crio-ME, la indexación de los patrones de difracción helicoidal, y procesamiento de imágenes y reconstrucción 3D utilizando IHRSR. En comparación con otras técnicas, la crio-ME ofrece la conservación óptima de muestras en condiciones casi nativo. Las muestras se insertan en una capa delgada de hielo vítreo, mediante la congelación rápida, y la imagen en los microscopios electrónicos en la temperatura del nitrógeno líquido, bajo condiciones de baja dosis para minimizar el daño por radiación. Las imágenes de muestra se obtienen en condiciones casi nativo a expensas de la señal de baja y de bajo contraste en las micrografías registrado. Afortunadamente, el proceso de reconstrucción helicoidal ha sido en gran parte automatizado, con la excepción de la indexación del patrón de difracción helicoidal. Aquí se describe un enfoque de índice de estructura helicoidal y determinar simetrías helicoidal (parámetros helicoidales) a partir de microfotografías digitales, un paso esencial para la reconstrucción 3D helicoidal. En pocas palabras, se obtiene un primer mapa 3D de la densidad por el método de IHRSR. Este mapa inicial se iterativamente refinados mediante la introducción de restricciones para los parámetros de alineación de cada segmento, por lo tanto el control de sus grados de libertad. Nuevas mejoras se consigue mediante la corrección de la función de transferencia de contraste (CTF) de la microscopía electrónica (corrección de la amplitud y fase) y mediante la optimización de la simetría helicoidal de la asamblea.
Protocol
1. Congelados-hidratados EM preparación de la muestra
Dado que el VIH-1 proteína de la cápside (CA) 9 asambleas son estables sólo en sal (NaCl 1M) de amortiguación, lo que contribuye el ruido de fondo fuerte en la crio-ME imágenes, se utiliza una dilución rápida y la espalda del lado del método secante para reducir transitoriamente la sal concentración en la preparación de la red de congelados-hidratados EM.
- Descarga luminiscente del carbono lado de R2 de malla 200 / 1 mallas de cobre en Quantifoil 25mA durante 25 segundos.
- Use un nebulizador para que la humedad en la cámara del medio ambiente, una de fabricación casera émbolo gravedad manual, al 80%.
- En el FEI Vitrobot émbolo dewar, etano líquido frío con nitrógeno líquido. Monte el dewar caída del punto de congelación en el émbolo de la gravedad manual.
- Aplicar 2,5 l de solución pre-ensamblados CA en el lado de carbono de la red, que se monta en unas pinzas, y la carga de las pinzas en el émbolo con el lado de carbono de la red de espaldas a usted.
- Añadir 3 l de tampón de dilución baja de sal (NaCl 100 mM) a la parte de atrás de la parrilla e inmediatamente secar la parte de atrás de la parrilla con un trozo de papel de filtro. La superficie de toda la espalda de la parrilla debe estar en estrecho contacto con el papel de filtro durante aproximadamente 6 segundos, antes de retirar el papel de filtro. Inmediatamente caída de la red en etano líquido después de quitar el papel de filtro.
- Quite las pinzas del émbolo y rápida transferencia de la red en una caja de almacenamiento de red.
2. Crio-microscopía electrónica de CA asambleas tubular
- La carga de la red congelados-hidratados en un operativo FEI Polara microscopio de electrones G2 en 200kV y equipado con una cámara Gatan 4Kx4K CCD.
- En dosis bajas-el modo de búsqueda, con un aumento de ~ 200x y con una dosis <0.001e - / A 2, pantalla de toda la parrilla de las zonas con hielo adecuado y guardar las posiciones de estas áreas en un fichero de escenario.
- Recordar las posiciones de guarda y la pantalla más estas áreas con un aumento de 3.900 x en bajas dosis, el modo de búsqueda. Seleccione las áreas con una capa uniforme y delgada de hielo que contienen bien separados, largos tubos en los agujeros, para la recolección de datos. Guardar la ubicación de estas áreas en un archivo de la segunda etapa.
- Cambiar a modo de exposición con un aumento de 59.000 x, la inserción de 100 micras de apertura el objetivo, y ajustar la estigmatización objetivo y la intensidad del haz de una dosis de ~ 15 e - / 2 por la exposición.
- Volver al modo de baja dosis de búsqueda, pasar a una posición guardada e identificar y centro de un tubo de buen uso de la cámara CCD. Cambiar al modo de enfoque, ajuste el enfoque, y establecer un valor de desenfoque, m normalmente entre 0,5 a 2,5. Cambiar al modo de exposición, establezca un tiempo de exposición de 0.3 a 0.5 segundos, para una dosis de 15 e - / A 2, y recoger una imagen. Las imágenes se recogen en una cámara de placa, y las películas deben dejarse en reposo durante 10 segundos antes de que la foto está tomada.
- Pasar a la siguiente posición guardada y repita el paso 5 para recoger más imágenes.
- Las películas se desarrollan con toda su fuerza D19 durante 12 minutos y digitalizadas utilizando una Nikon Super Coolscan 9000 ED Escáner en un tamaño de píxel de 6.35 micras. El formato de archivos de imagen TIFF es.
3. Helicoidal de indexación
Un objeto helicoidales pueden ser indexados por dos parámetros: el fin de Bessel, n, y el número de capa de línea, l. Cada línea de la capa en la transformada de Fourier, que se caracteriza por (n, l), corresponde a un conjunto de líneas en la red la superficie del objeto helicoidal denota por (h, k) los índices, usando la notación de una red en 2D. Para cualquier (h, k), una línea de capa (n hk, l hk) es una combinación lineal de dos vectores básicos (n = 10, L 10) y (n 01, l 01), que son los valores de n y l las dos principales líneas de capa (1, 0) y L (0, 1). se puede obtener a partir de la altura de la línea de capa medida a lo largo del eje Z en la transformada de Fourier. El valor de n se puede estimar mediante la siguiente ecuación 10
πRr ≈ ≈ 1,1 J n | n | -0,9 .....................( 1)
donde J n es la función de Bessel, que determina la intensidad de la línea n º capa, r es el radio del objeto helicoidal, y R es el radio de la amplitud máxima de la línea de la capa. El número de línea de capa, l, se relaciona con n por la regla de selección 11
l = tn + um ....................( 2)
donde T y U son constantes de la hélice. Para cualquier hélice dada, puede haber unidades exactamente u exactamente (o muy cerca) t complete vueltas.
- Caja con un tubo relativamente recto y largo con un diámetro uniforme con el programa de EMAN 12 helixboxer y guardar la imagen en formato de MRC.
- Determinar la distancia de repetición helicoidal, c, utilizando un programa basado en la correlación cruzada, tales como "imgccf ', en el paquete de MRC 13.
- Calcular la transformada de Fourier con una longitud de caja nueva que es una parte integral de la distancia de repetición, c.
- Elija dos líneas principales que definen la capa de dos vectores básicos de red de superficie (1,0) y (0,1).
- Medir el radio del tubo, r, y la altura y el radio de las dos líneas principales en la capa transformada de Fourier, l 10, R 10, L 01 R 01, respectivamente (Fig. 1).
- Calcular n n 10 y 01 de acuerdo a la ecuación (1).
- Dado que los valores n son sólo estimaciones, unas cuantas combinaciones de n 10 y 01 n se ponen a prueba en pasos posteriores (véase el paso 4.2) para encontrar el correcto uso de la simetría helicoidal IHRSR paquete de programas.
- Calcular la simetría tornillo descrita por dos números reales: la rotación entre las subunidades (Δφ) y el aumento axial (Δz) de la hélice de una estrella (n = 1). Teniendo en cuenta l 10, l 01, n 10, y los valores de n 01, U y T se puede obtener mediante pruebas de un rango de valores m (por ejemplo, -50 <m <50) de acuerdo con la regla de selección. Por último, Δφ y Δz se calculan utilizando Δφ = 360 t / u, y Δz = c / u.
4. La reconstrucción tridimensional
- Segmentación de partículas
- Abrir una micrografía que contiene partículas de helicoidal, con el boxeador programa gráfico, que es un programa en el paquete de EMAN.
- Corte helicoidal de la partícula en superposición de los segmentos. En el panel de control de Boxer, elegir el modo de hélice y establecer los parámetros para el boxeo: el tamaño de la caja debe ser más grande que el diámetro de la partícula y el valor de "Olap" debe ser aproximadamente el 90% del tamaño de la caja.
- Después de hacer clic izquierdo en cada extremo de la partícula helicoidal, Boxer se generará automáticamente una serie de cuadros de partículas a lo largo de la longitud de la hélice.
- Guardar los segmentos de caja, así como sus coordenadas.
- Inicial de la reconstrucción en 3D utilizando programas IHRSR
- Invertir el contraste de las imágenes de la crio-ME y aplicar filtros de paso bajo 14 (opcional) antes de su procesamiento con el verdadero método iterativo helicoidal reconstrucción del espacio (IHRSR).
- Abra la interfaz gráfica del programa de IHRSR escribiendo "generador". Proporcionar la interfaz gráfica con toda la información de la pila de partículas en caja, incluyendo el nombre y la ruta de la pila, el número de imágenes en la pantalla, los valores de los parámetros de simetría, etc Haga clic en el botón "Finalizar" para crear el guión de la reconstrucción, b25.spi.
- Use un cilindro macizo o hueco, como una referencia inicial y permitir que el procedimiento para el ciclo hasta que no haya cambios en la simetría de tornillo definida, que ocurre generalmente después de algunos ciclos. El derecho de simetría helicoidal debe dar una forma estable de reconstrucción convergente. La reconstrucción generado en el último ciclo se utilizará como referencia inicial para un mayor refinamiento. IHRSR realiza la reconstrucción 3D utilizando programas de SPIDER.
- Reconstrucción con refinamiento iterativo 15 La reconstrucción 3D generada por IHRSR ahora se utiliza como referencia inicial para el refinamiento adicional. Durante el refinamiento, la simetría helicoidal se fija en Δφ y Δz, que se determinan a partir del procedimiento IHRSR.
- Determinar el desenfoque y el astigmatismo presentes en la micrografía utilizando programas CTFFIND3 y CTFTILT 16.
- Multiplicar los segmentos de partículas por el uso de programas CTF SPIDER 17. La operación denominada FT en la sala de SPIDER se utiliza para calcular la transformada de Fourier (FFT) de la imagen 2D. A partir de entonces, la FFT se multiplica por los valores de CTF, determinado en los pasos anteriores, utilizando la operación denominada MU dentro del conjunto de SPIDER. El valor obtenido se transformó inversa hacia atrás para formar una nueva imagen (CTF-corregido) en el espacio real con la operación de SPIDER, FT de nuevo.
- Realizará comparaciones de proyección mediante la comparación de las proyecciones de los volúmenes de referencia con la CTF-corregido imágenes usando multi-referencia de alineación. La variación en el ángulo de inclinación fuera del avión se limita a + / -10 ° y se tomaron muestras en pasos de 1 °. Introducir restricciones, como los coeficientes de correlación, en el plano ángulos cercanos a 0 º o 180 º, y limitada X turnos, para los parámetros de alineación de cada segmento. Incluir en la reconstrucción sólo aquellos segmentos que satisfacen las restricciones.
- Después de cada ciclo iterativo refinamiento, una reconstrucción en 3D se genera mediante la proyección de vuelta y se divide por la suma sobre el CTF2.
- Imponer la simetría helicoidal para generar un volumen simetrizada. El refinamiento iterativo se termina cuando no hay mejora en la resolución de la nueva reconstrucción en 3D se produce.
- El procesamiento de imágenes SPIDER paquete se utiliza para la mayoría de los pasos de refinamiento. Una serie de operaciones son controladas por los scripts de araña, que son creados por el usuario los archivos de control de proceso por lotes que contienen secuencias de las operaciones y valores de los parámetros. La reconstrucción final se calcula utilizando los programas de SPIDER suite.
5. Los resultados representativos:
Un solo de VIH-1 CA A92E tubo (Fig. 1a) estaba en caja y su transformada de Fourier (fig. 1b) se calculó para la indexación helicoidal. Para las líneas de la capa (1, 0) y (0, 1), l 10 = 28, l 01 = 37, R 10 = 55, R 01 = 44. Teniendo en cuenta un radio de tubo de 211.57Å, nos aproxima n 10 =- 12, n 01 = 11 (en este caso, la imparcialidad estaba predeterminado). Con una distancia de repetición de 5195.48Å, la simetría del tornillo del tubo se determinó como Δz = 6.8093Å, Δφ = 328,88 °. Δz y Δφ se perfeccionaron a 7.1321Å y 328,86 ° utilizando IHRSR (Fig. 2a) y la reconstrucción inicial se muestra en la figura. 2b. La reconstrucción final (Fig. 3), después de refinamiento iterativo, la mejora del mapa de densidad de manera significativa a partir del modelo inicial calculada con IHRSR (Fig. 2b).
Figura 1. Indexación del VIH-1 CA tubo helicoidal. (A) Un solo por VIH-1 CA de tubo de imagen A92E. Barra de escala, 30 nm. (B) La transformada de Fourier de la sonda se muestra en (A). Los índices helicoidal (n = 10 =- 12, n = 01 11) se indican. Los puntos de punta de flecha a la línea de capa a una resolución de 23 bis.
Figura 2. Una reconstrucción inicial con IHRSR. (A) Tornillo de la determinación de la simetría de cada ciclo iterativo. Δφ y Δz, a partir de los valores iniciales, coinciden en los valores estables después de 10 ciclos iterativos refinamiento. (B) El primer mapa 3D de la densidad después de 10 ciclos iterativos.
Figura 3. El mapa de densidad de 3D después de que el refinamiento iterativo. (AC) El mapa de densidad de los tubos de CA se muestra como tres rebanadas ortogonal: paralelo al eje del tubo y cerca de la superficie (A), perpendicular al eje del tubo (B), y en paralelo ya través del eje del tubo (C) . Las barras de escala, 10 nm. (D) la representación de la superficie de la mapa de densidad de contornos 3D en 1.8s adjuntando volumen de 100%.
Discussion
Se presenta un conjunto de protocolos para proporcionar un método directo para obtener las estructuras 3D de los objetos helicoidales. Utilizando los procedimientos descritos, hemos adquirido una estructura 3D del VIH-1 de la Asamblea cápside de un único tubo de imagen (176 segmentos). Estructuras superiores de resolución se puede lograr mediante la inclusión de más datos de la imagen.
Hay varios puntos críticos para la recolección de datos óptimo y análisis: En primer lugar, durante la preparación de una muestra de la crio-ME, la solución de la muestra debe ser borrado, dejando una capa uniforme y delgada de solución que es ligeramente más grueso que el tamaño de la muestra. Hay varias maneras de secar la muestra. De las células bacterianas y las muestras tubulares, como el VIH-1 de la Asamblea CA, borrando de un solo lado, sobre todo de la parte posterior del lado, es el más apropiado.
En segundo lugar, la imparcialidad de la hélice debe ser determinado, ya que esto no se puede hacer mediante la indexación de hélice o de reconstrucción. Una práctica común es usar hielo-grabado, seguido por el Rotary sombra 18 para determinar la lateralidad. Imparcialidad también se puede determinar después de la reconstrucción cuando la resolución del mapa de densidad es suficientemente alta, los modelos 3D atómica de los componentes individuales deben encajar muy bien en el mapa de densidad cuando se supone correcta imparcialidad. De lo contrario, la imparcialidad contrario se debe asumir.
En tercer lugar, un filtro de Wiener se debe utilizar durante el procesamiento de imágenes, tanto la fase de corrección y amplitud, para reducir la amplificación de ruido. Dado que la CTF a partir de una sola imagen siempre tiene cruces por cero, parte de la información en el espacio recíproco se ha perdido. Por lo tanto, es necesario disponer de datos de múltiples conjuntos de proyección incluido para la reconstrucción 3D, imágenes en cada uno de los valores de desenfoque diferentes.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer al Dr. Zhao y Gongpu Ke Danxia de apoyo técnico. Agradecemos a los Dres. Edward Egelman y Grigorieff Niko para compartir su software de procesamiento de imágenes. Reconocemos también el personal que apoya la Biología Estructural crio-ME instalaciones y cluster Beowulf y la red de la Universidad de la Escuela de Medicina de Pittsburgh. Este trabajo fue apoyado por GM082251 y GM085043.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glow-discharge device 100X | Glow-discharge device 100X | ||
| Tecnai Polara F30 microscope with a Field Emission Gun | FEI | ||
| Gatan 4K x 4K CCD camera | Gatan | ||
| Plunge-freezing device | Home-made manual gravity plunger | ||
| Quantifoil R2/1 200 mesh holely-carbon copper grids | Quantifoil Micro Tools | ||
| EM software EMAN | http://blake.bcm.edu/EMAN/ | ||
| EM software IHRSR | Programs available from Edward H. Egelmanhttp://people.virginia.edu/~ehe2n/ | ||
| EM software Spider | http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html | ||
| MRC based helical processing software | Programs available from Koji Yonekurahttp://www.riken.jp/biostrmech/index.html | ||
| CTFFIND3/CTFTILT and Real-space helical refinement software | http://emlab.rose2.brandeis.edu/software |
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