Summary
Dit artikel beschrijft een methode om een drie-dimensionale (3D) structuur van spiraalvormig geassembleerd moleculen met behulp van cryo-elektronenmicroscopie te verkrijgen. In dit protocol maken we gebruik van HIV-1 capside vergaderingen om de gedetailleerde 3D-reconstructie procedure te illustreren voor het bereiken van een dichtheid kaart door de iteratieve rechte real-ruimte reconstructie methode.
Abstract
Cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM), gecombineerd met beeldverwerking, is een steeds krachtige tool voor de structuur bepaling van de macromoleculaire eiwitcomplexen en samenstellingen. In feite hebben enkel deeltje elektronen microscopie een en twee-dimensionale (2D) elektronen kristallografie twee zijn geworden relatief routine methodieken en een groot aantal structuren opgelost met behulp van deze methoden. Tegelijkertijd heeft beeldverwerking en drie-dimensionale (3D) reconstructie van spiraalvormige objecten snel ontwikkeld, met name, de spiraalvormige real-ruimte reconstructie (IHRSR) methode 3, die enkel deeltje analyse-instrumenten gebruikt in combinatie met spiraalvormige symmetrie iteratief. Veel biologische entiteiten functie in draadvormige of schuine vormen, met inbegrip van actine filamenten 4, 5 microtubuli, amyloïde vezels 6, tabak mozaïek virus 7, 8 en bacteriën flagella, en omdat een 3D-dichtheid kaart van een spiraalvormige entiteit kan worden bereikt vanaf een projectie beeld, in vergelijking met de vele beelden die nodig zijn voor 3D-reconstructie van een niet-helix object, met de IHRSR methode, structurele analyse van dergelijke flexibele en verstoorde spiraalvormige vergaderingen is nu bereikbaar.
In deze video artikel, bieden we gedetailleerde protocollen voor het verkrijgen van een 3D-dichtheid kaart van een spiraalvormige eiwit vergadering (HIV-1 capside 9 is ons voorbeeld), inclusief protocollen voor cryo-EM prepareren, lage dosis de gegevensverzameling door de cryo-EM, indexeren van rechte diffractie patronen, en beeldverwerking-en 3D-reconstructie met behulp van IHRSR. In vergelijking met andere technieken, cryo-EM biedt optimale bescherming monster onder near native omstandigheden. Monsters zijn ingebed in een dunne laag van glasvocht ijs, door snel invriezen, en afgebeeld in elektronenmicroscopen temperatuur van vloeibare stikstof, onder lage dosis voorwaarden aan de straling schade te minimaliseren. Sample beelden worden verkregen onder near native omstandigheden ten koste van de lage signaal-en laag contrast in het opgenomen microfoto. Gelukkig is het proces van het spiraalvormige reconstructie grotendeels geautomatiseerd, met uitzondering van de indexering van de spiraalvormige diffractiepatroon. Hier beschrijven we een benadering van de index spiraalvormige structuur en bepaal spiraalvormige symmetrieën (helical parameters) van gedigitaliseerde microfoto, een essentiële stap voor 3D-helix wederopbouw. Kortom, we krijgen een eerste 3D-dichtheid kaart door het toepassen van de IHRSR methode. Deze eerste kaart wordt vervolgens iteratief verfijnd door de invoering van beperkingen voor de uitlijning parameters van elk segment, waardoor de controle op hun vrijheidsgraden. Verdere verbetering wordt bereikt door te corrigeren voor het contrast overdracht functie (CTF) van de elektronenmicroscoop (amplitude en fase correctie) en door het optimaliseren van de spiraalvormige symmetrie van de montage.
Protocol
1. Frozen-gehydrateerd EM prepareren
Omdat HIV-1 capside-eiwit (CA) samenstellingen 9 stabiel zijn alleen in hoge zout (1 M NaCl) buffer, die een sterke achtergrond geluid in cryo-EM beelden draagt, gebruiken we een snelle verdunning en back-side blotting methode om tijdelijk minder zout concentratie bij de voorbereiding van de bevroren gehydrateerd EM grid.
- Glimontlading de koolstof kant van de 200-mesh R2 / 1 Quantifoil koperen roosters onder 25mA voor 25 seconden.
- Gebruik een vernevelaar om de vochtigheid in de milieu-kamer, een zelfgemaakte handleiding zwaartekracht zuiger, te brengen tot 80%.
- In de FEI Vitrobot Plunger Dewar, koele vloeistof ethaan met behulp van vloeibare stikstof. Monteer de duik-bevriezing Dewar op de handleiding zwaartekracht zuiger.
- Van toepassing zijn 2,5 ul van voorgemonteerde CA oplossing op de koolstof-kant van het net, die is gemonteerd op een tang, en laad de tang op de zuiger met de koolstof-kant van het net van u af.
- Voeg 3 pi van een laag zout verdunning buffer (100 mM NaCl) aan de achterkant van de grid en onmiddellijk blot de achterkant van de grid met een stuk filtreerpapier. De hele achterkant van de grid moet in nauw contact met de filter papier voor ongeveer 6 seconden, voordat u de filter papier. Onmiddellijk duiken het rooster in vloeibare ethaan na het verwijderen van het filter papier.
- Verwijder de tang uit de zuiger en snel het net te zetten in een raster opbergdoos.
2. Cryo-elektronenmicroscopie van CA buisvormige assemblages
- Laad de bevroren gehydrateerd rooster in een FEI Polara G2 elektronenmicroscoop werken op 200kv en voorzien van een Gatan 4Kx4K CCD camera.
- Onder een lage dosis-search-modus, bij een vergroting van ~ 200x en met een dosis <0.001e - / A 2, het scherm van de hele grid voor gebieden met geschikte ijs en red de posities van deze gebieden in een fase-bestand.
- Roep de opgeslagen posities en verder het scherm van deze gebieden op een vergroting van 3900 x in lage dosis-search mode. Kies de gebieden met een gelijkmatige, dunne laag van ijs met goed gescheiden, lange buizen meer dan gaten, voor het verzamelen van gegevens. Sla de locaties van deze gebieden in een tweede fase-bestand.
- Schakel over naar belichtingsstand bij een vergroting van 59.000 x, inzet een 100 um objectieve diafragma, en stel het doel stigmatism en bundelintensiteit voor een dosis van ~ 15 e - / A 2 per blootstelling.
- Keer terug naar de lage-dosis-modus voor het zoeken, ga dan naar een opgeslagen positie en identificeren en in het midden een goede buis met de CCD camera. Schakelaar om de scherpstelling modus, om de focus, en stel een defocus waarde, normaal gesproken tussen 0,5 en 2,5 um. Schakel over naar de belichting, stelt een belichtingstijd 0,3-0,5 seconde, voor een dosis van 15 e - / A 2, en het verzamelen van een beeld. De beelden worden verzameld op een bord camera, en de films zou moeten worden toegestaan om zich te vestigen voor het 10 seconden voordat een opname wordt gemaakt.
- Ga naar de volgende opgeslagen positie en herhaal stap 5 om meer afbeeldingen te verzamelen.
- De films zijn ontwikkeld in volle kracht D19 gedurende 12 minuten en gedigitaliseerd met behulp van een Nikon Super Coolscan 9000 ED scanner op een pixelgrootte van 6,35 micrometer. Het formaat van beeldbestanden is TIFF.
3. Helical indexering
Een spiraalvormig object kan worden geïndexeerd door twee parameters: de Bessel-order, n, en laag lijnnummer, l. Elke laag lijn in de Fourier-transformatie, zoals gekenmerkt door (n, l), komt overeen met een reeks van lijnen op het oppervlak rooster van het spiraalvormige object aangegeven met (h, k) indices, met behulp van de notatie van een 2D-rooster. Voor elke (h, k), een (n hk, l hk) laag lijn is een lineaire combinatie van twee fundamentele vectoren (n 10, l 10) en (n 01, l 01), die de n en l-waarden van de de twee belangrijkste lagen lijnen (1, 0) en (0, 1). l kan worden verkregen bij de laag regelhoogte gemeten langs Z-as in de Fourier-transformatie. De waarde van n kan worden geschat met behulp van de volgende vergelijking 10
πRr ≈ ≈ 1,1 J n | n | -0,9 .....................( 1)
waar J n de Bessel-functie, die de intensiteit van de n-de laag regel bepaalt, r is de straal van de spiraalvormige object, en R is de straal van de maximale amplitude van de laag lijn. De laag regelnummer, l, is gerelateerd aan n van de selectie regel 11
l = tn + um ....................( 2)
waar T en U zijn constanten van de helix. Voor een gegeven helix, kan er precies u units in exact (of zeer nauw) t complete bochten.
- Box uit een relatief rechte en lange buis met een uniforme diameter van het gebruik van de EMAN programma van 12 helixboxer en sla de afbeelding in MRC-formaat.
- Bepaal de helical herhalen afstand, c, met behulp van een cross-correlatie gebaseerd programma, zoals 'imgccf', in de MRC-pakket 13.
- Het berekenen van de Fourier-transformatie, met een nieuwe doos lengte die is een integraal van de herhaling afstand, c.
- Kies twee belangrijkste lagen lijnen die twee fundamentele oppervlakte rooster vectoren (1,0) te definiëren en (0,1).
- Meet de straal van de buis, r, en de hoogte en de straal van de twee belangrijkste lagen lijnen in een Fourier transform, L 10, R 10, L 01 R 01, respectievelijk (afb. 1).
- Bereken n 10 en n 01 volgens vergelijking (1).
- Omdat n-waarden zijn slechts schattingen, zijn een paar combinaties van n 10 en n 01 getest in latere stappen (zie stap 4.2) in de juiste spiraalvormige symmetrie gebruik van het programma-pakket IHRSR te vinden.
- Bereken de schroef symmetrie beschreven door twee reële getallen: de rotatie tussen de subeenheden (Δφ) en de axiale stijging (Δz) van de een-ster helix (n = 1). Gezien l 10, 01 l, n 10, 01 en n-waarden, kan u en t worden verkregen door het testen van een reeks van m-waarden (bijvoorbeeld, -50 <m <50) op basis van de selectie regel. Tot slot worden Δφ en Δz berekend met behulp van Δφ = 360 t / u en Δz = c / u.
4. Drie-dimensionale reconstructie
- Particle segmentatie
- Open een microfoto met spiraalvormige deeltjes, met behulp van het grafische programma Boxer, dat is een programma in de EMAN pakket.
- Snijd de helical deeltje in overlappende segmenten. In het bedieningspaneel van de Boxer, kies Helix-modus en de parameters voor boksen: de grootte van de doos moet groter zijn dan de diameter van de deeltjes en de waarde voor 'OLAP' moet ~ 90% van de doos grootte.
- Na de linkermuisknop te klikken op de beide uiteinden van de spiraalvormige deeltje, zal Boxer automatisch genereren van een reeks deeltje dozen langs de helix lengte.
- Bewaar boxed segmenten en hun coördinaten.
- De eerste 3D-reconstructie met behulp van programma's IHRSR
- Invert het contrast van de cryo-EM beelden en toe te passen low-pass filter 14 (optioneel) voorafgaand aan de verwerking met het iteratieve spiraalvormige werkelijke ruimte reconstructie methode (IHRSR).
- Open de grafische interface van IHRSR programma door te typen "Generator". Zorg voor de grafische interface met alle informatie voor de boxed deeltjes stack, inclusief de naam en het pad van de stapel, het aantal afbeeldingen in de stack, de waarden voor de parameters symmetrie, etc. Klik op de knop "Finish" om de wederopbouw script te maken, b25.spi.
- Gebruik een massieve of holle cilinder als een eerste referentie en kan de procedure om te fietsen totdat er geen wijzigingen in de gedefinieerde schroef symmetrie, die meestal optreedt na een paar cycli. Een recht helical symmetrie moet geven een stabiel geconvergeerd reconstructie. De reconstructie gegenereerd in de laatste cyclus zal worden gebruikt als een eerste referentie voor verdere verfijning. IHRSR voert 3D reconstructie met behulp van SPIDER-programma's.
- Reconstructie met iteratieve raffinement 15 De 3D-reconstructie die door IHRSR wordt nu gebruikt als een eerste referentie voor extra verfijning. Tijdens de verfijning, is de spiraalvormige symmetrie vastgesteld op Δφ en Δz, die worden bepaald door de IHRSR procedure.
- Bepaal de onscherp en astigmatisme aanwezig zijn in de microfoto gebruik van programma's CTFFIND3 en CTFTILT 16.
- Vermenigvuldig deeltje segmenten door de CTF behulp van SPIDER-programma's 17. De operatie genoemd FT in de SPIDER suite wordt gebruikt om de Fourier transformatie (FFT) van de 2D-afbeelding te berekenen. Daarna wordt de FFT vermenigvuldigd met CTF, bepaald in de vorige stappen, met behulp van de operatie genoemd MU binnen de SPIDER suite. De verkregen waarde wordt vervolgens omgekeerd weer getransformeerd tot een nieuw beeld (CTF-gecorrigeerd) in de reële ruimte met behulp van de SPIDER werking vorm, FT weer.
- Voer projectie matching door het vergelijken van projecties van de referentie-volumes met de CTF-gecorrigeerde beelden, het gebruik van multi-referentie-alignment. De variatie in de out-of-plane hoek is beperkt tot + / -10 ° C en bemonsterd in 1 ° stappen. Invoering van beperkingen, zoals een hoge correlatie coëfficiënten, in het vlak hoeken in de buurt van 0 ° of 180 °, en beperkte x-verschuivingen, voor de uitlijning parameters van elk segment. Onder meer bij de wederopbouw alleen die segmenten die de randvoorwaarden te voldoen.
- Na elke iteratieve verfijning cyclus, is een 3D-reconstructie gegenereerd met behulp van back projectie en gedeeld door som over de CTF2.
- Opleggen van de schuine symmetrie om een symmetrized volume te genereren. De iteratieve verfijning wordt beëindigd wanneer geen verdere verbetering van de resolutie van de nieuwe 3D-reconstructie plaatsvindt.
- De beeldverwerking-pakket SPIDER wordt gebruikt voor het grootste deel van de verfijning stappen. Een reeks van activiteiten worden gecontroleerd door SPIDER scripts, die door de gebruiker gemaakte batch control-bestanden met sequenties van operaties en parameterwaarden. De uiteindelijke reconstructie wordt berekend met behulp van programma's in SPIDER suite.
5. Representatieve resultaten:
Een HIV-1 CA A92E buis (Fig. 1a) was boxed uit en zijn Fourier transform (Fig. 1b) werd berekend voor spiraalvormige indexering. Voor laag-lijnen (1, 0) en (0, 1), l 10 = 28, l 01 = 37, R 10 = 55, R 01 = 44. Gegeven een tube straal van 211.57Å, we benaderd n 10 =- 12, n 01 = 11 (hier de willekeur was vooraf bepaald). Met een herhaling afstand van 5195.48Å, de schroef symmetrie van de buis werd bepaald als Δz = 6.8093Å, Δφ = 328,88 °. Δz en Δφ werden verfijnd om 7.1321Å en 328,86 ° met gebruikmaking van IHRSR (afb. 2a) en de eerste reconstructie is te zien in Fig. 2b. De uiteindelijke reconstructie (afb. 3), na iteratieve verfijning, verbetering van de dichtheid kaart sterk af van het eerste model berekend met IHRSR (afb. 2b).
Figuur 1. Indexering van HIV-1 CA spiraalvormige buis. (A) Een enkele HIV-1 CA A92E tube beeld. Schaalbalk, 30 nm. (B) De Fourier-transformatie van de buis die in (A). De spiraalvormige indices (n 10 =- 12, n = 01 11) worden aangeduid. De pijlpunt wijst naar de laag lijn 23A resolutie.
Figuur 2. Een eerste reconstructie met IHRSR. (A) Schroef symmetrie bepaling voor elke iteratieve cyclus. Δφ en Δz, uitgaande van de oorspronkelijke waarden, convergeren naar de stabiele waarden na 10 iteratieve verfijning cycli. (B) De eerste 3D-dichtheid kaart na 10 iteratieve cycli.
Figuur 3. De 3D-dichtheid map na de iteratieve verfijning. (AC) De dichtheid kaart van CA buizen wordt weergegeven als drie orthogonale plakjes: parallel aan de buis-as en dicht bij het oppervlak (A), loodrecht op de buis-as (B), en parallel aan en door de buis-as (C) . Schaal van bars, 10 nm. (D) Oppervlakte weergave van de 3D-dichtheid kaart contouren op 1.8s bijvoeging van 100% vol.
Discussion
We presenteren een reeks protocollen voor een eenvoudige benadering van 3D-structuren van de spiraalvormige objecten te verkrijgen. Met behulp van de beschreven procedures, hebben we in een 3D-structuur van HIV-1 capside montage van een enkele buis beeld (176 segmenten). Een hogere resolutie structuren kunnen worden bereikt door meer beeldgegevens.
Er zijn een aantal kritische punten voor een optimale gegevensverzameling en-analyse: Ten eerste, tijdens de voorbereiding van een cryo-EM monster, moet het monster oplossing weg uitgedelgd, waardoor een gelijkmatige, dunne laag van de oplossing die is iets dikker dan de steekproefomvang. Er zijn verschillende manieren om het monster blot. Voor bacteriële cellen en buisvormige exemplaren, zoals HIV-1 CA assemblage, blotting van de ene kant, met name uit de back-side, het meest geschikt is.
Ten tweede, de handigheid van de helix moet worden bepaald, omdat deze niet kan worden gedaan door rechte indexeren of wederopbouw. Een veel voorkomende praktijk is het gebruik van vries-etsen, gevolgd door een roterende shadowing 18 tot linkshandigheid te bepalen. Onpartijdigheid kan ook worden bepaald na de reconstructie bij de resolutie van de dichtheid kaart voldoende hoog is, de 3D-atomaire-modellen van de individuele componenten moeten goed passen in de dichtheid kaart wanneer er een correct linkshandigheid is verondersteld. Anders moet het tegenovergestelde willekeur worden aangenomen.
Ten derde moet een Wiener-filter gebruikt worden tijdens de beeldverwerking, voor zowel de fase en amplitude correctie, om ruis te verminderen versterking. Omdat de CTF van een enkel beeld heeft altijd nul kruisingen, is deel van de informatie in de reciproke ruimte verloren. Daarom is het noodzakelijk zijn om meerdere projectie gegevens sets opgenomen voor 3D-reconstructie, elk beeld gebracht bij verschillende defocus waarden.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs willen dr. Gongpu Zhao en Danxia Ke bedanken voor technische ondersteuning. Wij danken Drs. Edward Egelman en Niko Grigorieff voor het delen van hun software voor beeldverwerking. Erkennen wij ook de medewerkers die ondersteuning van de Structurele Biologie cryo-EM faciliteit en Beowulf cluster en rooster aan de Universiteit van Pittsburgh School of Medicine. Dit werk werd ondersteund door GM082251 en GM085043.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glow-discharge device 100X | Glow-discharge device 100X | ||
| Tecnai Polara F30 microscope with a Field Emission Gun | FEI | ||
| Gatan 4K x 4K CCD camera | Gatan | ||
| Plunge-freezing device | Home-made manual gravity plunger | ||
| Quantifoil R2/1 200 mesh holely-carbon copper grids | Quantifoil Micro Tools | ||
| EM software EMAN | http://blake.bcm.edu/EMAN/ | ||
| EM software IHRSR | Programs available from Edward H. Egelmanhttp://people.virginia.edu/~ehe2n/ | ||
| EM software Spider | http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html | ||
| MRC based helical processing software | Programs available from Koji Yonekurahttp://www.riken.jp/biostrmech/index.html | ||
| CTFFIND3/CTFTILT and Real-space helical refinement software | http://emlab.rose2.brandeis.edu/software |
References
- Frank, J., Radermacher, M. Three-dimensional reconstruction of single particles negatively stained or in vitreous ice. Ultramicroscopy. 46, 241-262 (1992).
- Henderson, R. Structure of Purple Membrane from Halobacterium-Halobium - Analysis of X-Ray-Diffraction Pattern. J Mol Biol. 93, 123-128 (1975).
- Egelman, E. H. The iterative helical real space reconstruction method: surmounting the problems posed by real polymers. J Struct Biol. 157, 83-94 (2007).
- Egelman, E. H., Francis, N., Derosier, D. J. F-Actin Is a Helix with a Random Variable Twist. Nature. 298, 131-135 (1982).
- Nogales, E., Whittaker, M., Milligan, R. A., Downing, K. H. High-resolution model of the microtubule. Cell. 96, 79-88 (1999).
- Jimenez, J. L. Cryo-electron microscopy structure of an SH3 amyloid fibril and model of the molecular packing. Embo J. 18, 815-821 (1999).
- Butler, P. J., Klug, A. Assembly of the particle of tobacco mosaic virus from RNA and disks of protein. Nat New Biol. 229, 47-50 (1971).
- Namba, K., Yamashita, I., Vonderviszt, F. Structure of the core and central channel of bacterial flagella. Nature. 342, 648-654 (1989).
- Byeon, I. J. L. Structural Convergence between Cryo-EM and NMR Reveals Intersubunit Interactions Critical for HIV-1 Capsid Function. Cell. 139, 780-790 (2009).
- Toyoshima, C., Unwin, N. Three-dimensional structure of the acetylcholine receptor by cryoelectron microscopy and helical image reconstruction. J Cell Biol. 111, 2623-2635 (1990).
- Toyoshima, C. Structure determination of tubular crystals of membrane proteins. I. Indexing of diffraction patterns. Ultramicroscopy. 84, 1-14 (2000).
- Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. EMAN: semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions. J Struct Biol. 128, 82-97 (1999).
- Yonekura, K., Toyoshima, C. Structure determination of tubular crystals of membrane proteins. IV. Distortion correction and its combined application with real-space averaging and solvent flattening. Ultramicroscopy. 107, 1141-1158 (2007).
- van Heel, M. Single-particle electron cryo-microscopy: towards atomic resolution. Q Rev Biophys. 33, 307-369 (2000).
- Sachse, C. High-resolution electron microscopy of helical specimens: A fresh look at Tobacco Mosaic Virus. J Mol Biol. 371, 812-835 (2007).
- Mindell, J. A., Grigorieff, N. Accurate determination of local defocus and specimen tilt in electron microscopy. J Struct Biol. 142, 334-347 (2003).
- Frank, J. SPIDER and WEB: Processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields. J Struct Biol. 116, 190-199 (1996).
- Zhang, P. J., Hinshaw, J. E. Three-dimensional reconstruction of dynamin in the constricted state. Nat Cell Biol. 3, 922-926 (2001).
