Den här artikeln beskrivs en metod för att få en tredimensionell (3D) strukturen av spiralformade samman molekyler med hjälp av cryo-elektronmikroskopi. I detta protokoll använder vi HIV-1 kapsid församlingar för att illustrera den detaljerade 3D-rekonstruktion förfarande för att uppnå en densitet kartan med den iterativa spiralformade verkliga rymden rekonstruktion metoden.
Cryo-elektronmikroskopi (Cryo-EM), kombinerat med bildbehandling, är ett allt kraftfullare verktyg för strukturbestämning av komplex makromolekylära protein och församlingar. I själva verket har enda partikel elektronmikroskopi 1 och två-dimensionella (2D) elektron kristallografi 2 har blivit relativt rutinmässiga metoder och ett stort antal strukturer lösts med hjälp av dessa metoder. Samtidigt har bildbehandling och tredimensionella (3D) rekonstruktion av raka föremål utvecklats snabbt, framför allt, den iterativa spiralformade verkliga rymden rekonstruktion (IHRSR) metod 3, som använder samma verktyg partikelanalys i samband med snedskurna symmetri. Många biologiska enheter funktion i trådar eller mycket riktade former, inklusive aktin filament 4, mikrotuberna 5, fibrer amyloid 6, tobak virus mosaik 7, och bakterier flageller 8, och eftersom en 3D täthet karta över en spiralformad enhet kan uppnås från en enda projektion bild, jämfört med många bilder som krävs för 3D-rekonstruktion av en icke-spiralformade objekt med IHRSR metod, strukturell analys av sådana flexibla och oordnat spiralformade församlingar är nu uppnås.
I denna video artikeln ger vi detaljerade protokoll för att få en 3D densitet karta över en spiralformad protein församling (HIV-1 kapsid 9 är vårt exempel), inklusive protokoll för Cryo-EM extraktion, låg dos datainsamling av Cryo-EM, indexering av raka diffraktion mönster och bildbehandling och 3D-rekonstruktion med hjälp IHRSR. Jämfört med andra tekniker, erbjuder Cryo-EM optimala exemplar bevaras på nära infödda förhållanden. Prover är inbäddade i ett tunt lager av glaskroppen is, genom snabb frysning, och avbildat i elektronmikroskop med flytande kväve temperatur, vid låga doser villkor för att minimera strålskador. Exempel på bilder som erhållits under nära infödda villkor på bekostnad av låg signal och låg kontrast i den inspelade micrographs. Lyckligtvis har processen med spiralformade återuppbyggnaden i stor utsträckning automatiserad, med undantag för indexering av spiralformade diffraktionsmönster. Här beskriver vi en metod att indexera spiralformade struktur och bestämma spiralformade symmetrier (spiralformade parametrar) från digitaliserade micrographs, ett viktigt steg för 3D snedskurna återuppbyggnad. Kortfattat, får vi en första 3D-täthet kartan genom att tillämpa IHRSR metoden. Denna första kartan är sedan iterativt förfinas genom att införa begränsningar för att anpassa parametrarna för varje segment och på så sätt kontrollera sina frihetsgrader. Ytterligare förbättringar uppnås genom att korrigera för kontrasten överföringsfunktionen (CTF) i elektronmikroskop (amplitud och fas korrigering) och genom att optimera spiralformade symmetri församlingen.
Vi presenterar en uppsättning protokoll för att ge en okomplicerad metod för att få 3D-strukturer av raka objekt. Använda de beskrivna förfarandena förvärvade vi en 3D-struktur av HIV-1 kapsid församling från en enda tub bild (176 segment). Högre upplösning strukturer kan uppnås genom att ta mer bilddata.
Det finns flera kritiska punkter för optimal datainsamling och analys: Först, under beredningen av ett Cryo-EM prov, bör provlösningen torkas bort och lämnar en enhetlig, tunt lager av lösning som är något tjockare än urvalets storlek. Det finns flera olika sätt att utplåna provet. För bakterieceller och tubulär prover, såsom HIV-1 CA montering, läskpapper från en sida, särskilt från back-sidan är mest lämplig.
För det andra behöver handedness av spiralen som skall fastställas, eftersom detta inte kan göras av spiralformade indexering eller återuppbyggnad. En vanlig metod är att använda freeze-etsning, följt av roterande skugga 18 för att avgöra opartiskhet. Handedness kan också bestämmas efter återuppbyggnaden när upplösningen på densiteten kartan är tillräckligt hög, 3D-atomära modeller av enskilda komponenter ska passa väl in i tätheten kartan när en korrekt handedness förutsätts. Annars bör det motsatta handedness antas.
Det tredje bör en Wiener-filter användas under bildbehandling för både fas och amplitud korrigering, för att minska buller förstärkning. Eftersom CTF från en enda bild har alltid nollgenomgångar är en del av informationen i ömsesidiga rymden förlorade. Därför är det nödvändigt att ha flera projektion datamängder ingår för 3D-rekonstruktion, var avbildad på olika minskad fokus värden.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Dr Gongpu Zhao och Danxia Ke för teknisk support. Vi tackar Dr. Edward Egelman och Niko Grigorieff för att dela sina bildbehandlingsprogram. Vi erkänner också den personal som stödjer Strukturbiologi Cryo-EM anläggning och Beowulf kluster och rutnätet vid University of Pittsburgh School of Medicine. Detta arbete stöddes av GM082251 och GM085043.
Name | Source | Comments |
Glow-discharge device 100X | Glow-discharge device 100X | |
Tecnai Polara F30 microscope with a Field Emission Gun | FEI, Hillsboro, OR | |
Gatan 4K x 4K CCD camera | Gatan, Pleasanton, CA | |
Plunge-freezing device | Home-made manual gravity plunger | |
Quantifoil R2/1 200 mesh holely-carbon copper grids | Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany | |
EM software EMAN | http://blake.bcm.edu/EMAN/ | |
EM software IHRSR | http://people.virginia.edu/~ehe2n/ | Programs available from Edward H. Egelman |
EM software Spider | http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html | |
MRC based helical processing software | http://www.riken.jp/biostrmech/index.html | Programs available from Koji Yonekura |
CTFFIND3/CTFTILT and Real-space helical refinement software | http://emlab.rose2.brandeis.edu/software |