Summary
و
Abstract
لتحليل مورفولوجيا محواري وشجيري الخلايا العصبية ، فمن الضروري الحصول على العلامات الدقيقة الهياكل العصبية. تحضير عينات المسمى جيدا مع قليل من دون تلف الأنسجة تمكننا من تحليل الخلايا والتشكل لمقارنة العينات الفردية لبعضهم البعض ، مما يسمح بالتالي تحديد الحالات الشاذة متحولة.
في أسلوب أظهر تشريح الجهاز العصبي لا يزال معظمهم داخل يطير الكبار. من خلال شق ظهري ، يتم فتح البطن والصدر ويتم إزالة معظم الأعضاء الداخلية. ويتعرض فقط الجانب الظهري للحبل العصب البطنية (VNC) وسرطان عنق الرحم الضامة (سي) التي تحتوي على محاور عصبية كبيرة من الألياف العملاقة (GFS) 1 ، في حين أن المخ يحتوي على خلايا الجسم والتشعبات GF يبقى 2 في الرأس سليما . وينبغي في هذا التحضير لا تزال تعلق معظم أعصاب VNC لعضلاتهم.
بعد التشريح ، ويتجلى ملء الخلايا من الألياف العملاقة (GF) مع صبغة الفلورسنت. في سي تقع المحاوير GF على السطح الظهري ، وبالتالي يمكن تصور بسهولة تحت المجهر مع النقيض تدخل الفرق (DIC) البصريات. هذا يسمح للحقن المحاوير GF مع صبغة في هذا الموقع لتسمية GF بأكملها بما في ذلك المحاور والمحطات الخاصة في فنك. هذا الأسلوب يؤدي إلى تلطيخ موثوقة وقوية من GFS السماح تصوير الخلايا العصبية على الفور بعد ملء مع epifluorescent المجهر. بدلا من ذلك ، يمكن تعزيز إشارة الفلورسنت القياسية المناعية باستخدام الإجراءات المناسبة للفحص المجهري 3 ارتفاع القرار مبائر.
Protocol
1. تشريح الأعصاب من الحبل البطني
يمكن إجراء تشريح وصبغ لملء GF في درجة حرارة الغرفة. تشريح لجميع الخطوات الباردة (4 درجات مئوية) وينبغي استخدام المياه المالحة لإبطاء عملية التمثيل الغذائي والحفاظ على الخلايا العصبية على قيد الحياة لفترة أطول.
- تخدير الذباب الكبار (4 أيام أو أكثر) مع CO 2 أو البرد منهم على الجليد حتى يجمد فيها. والتخدير مع الثلج تتطلب المزيد من الوقت (حتى 30 دقيقة) ، ولكن سوف تبقي الذباب يجمد لمدة أطول.
- مكان واحد يطير في طبق بتري Sylgard المغلفة. تشريح هذا يتطلب استخدام التكبير عالية (80 100X) stereomicroscope تشريح.
- Vannas مع مقص ، وإزالة الساقين ، خرطوم ، والأجنحة.
- استخدام ملقط الخشنة ودبابيس الحشرات الجميلة (دبابيس minutien) لتوجيه الجانب الظهري حتى ذبابة في صحن Sylgard. دبوس البطن أولا ثم استطال قليلا الحيوان من خلال وضع اثنين من المسامير على كل جانب من الرقبة وخلف الرأس ، بحيث امتدت قليلا الرقبة ويمكن الوصول إليها (انظر الشكل 2).
- تغرق الذبابة في العذبة ، والمياه المالحة الباردة ذبابة الفاكهة. الأكثر استخداما ملاحات ذبابة الفاكهة تكفي لتشريح ، ولكن نحن هنا استخدام المياه المالحة وصفها في قو O'Dowd ، 2006 4. وسوف فقاعة الهواء تحيط الطيران. إزالة الهواء مع حقنة.
- جعل قصيرة ، شق الوحشي في نهاية الظهرية من البطن. بدءا من شق ، وجعل الضحلة ، وقطع على التوالي على طول خط الوسط الظهرية من البطن في اتجاه الصدر. ثم يستمر في الضحلة ، وقطع طولية في الصدر ممكن بالتحديد على طول خط الوسط باتجاه الضام. فمن الأهمية بمكان لجعل التخفيضات الضحلة حتى لا تلحق الضرر VNC (الشكل 1).
- استخدام اثنين من دبابيس الحشرات الجميلة بعناية لفتح القفص الصدري. تنتشر في الجسم بعيدا نصفين باستخدام المسامير ووضع العلامات من خلال عضلات الطيران (الشكل 2). يجب أن لا يتم فتح القفص الصدري وكذلك صورت في الشكل 2 لتجنب تمزيق للبشرة. وينبغي لضمان التوجه مباشرة من فنك توضع المسامير في نفس الموقف الأمامي الخلفي في كل جانب.
- قد تكون عرقلت الوصول إلى VNC للحقن صبغة والتصوير المناسبة من جانب الأجهزة الداخلية. ولذلك ، استخدم ملقط ومقص لإزالة المعدة والأمعاء والقلب والأعضاء التناسلية. سحب الغدد اللعابية ملقاة على جانبي VNC. شطف تشريح بعناية مع المالحة جديدة لإزالة الأنسجة والدهون عائمة.
- إزالة الدهون في الجسم من تحت الضام عنق الرحم (سي). والدهون في الجسم مرئيا أفضل في التكبير عالية. استخدام ملقط غرامة على فهم دقيق لأنسجة من الجانب وتخلعها.
يمكن إجراء تشريح في غضون 5 إلى 10 دقائق. باستخدام العذبة ، والمياه المالحة الباردة سوف ، غير التالفة تشريح الجهاز العصبي لا تزال على قيد الحياة لمدة ساعة على الأقل.
2. GF ملء الخلايا
فمن المستحسن لتنفيذ صبغ ملء في أقرب وقت ممكن بعد تشريح.
- مكان الطبق Sylgard مع الذبابة تشريح تحت المجهر تستقيم مع مرحلة ثابتة (الشكل 3) وهدف الهواء 10X. مركز العينة مع نهاية الخلفي للتحرك نحو وضع صاحب القطب fill صباغة. على النقيض من استخدام التدخل التفاضلية (DIC) واسطة ، والتركيز على سي. يجب على المحاور الكبرى في GFS تكون مرئية بوضوح على السطح الظهري للسي.
- تمييع وسيفر الصفراء الملح dilithium CH في H2O منزوع الأيونات إلى تركيز 1 ٪. سحب كهربائي زجاج البورسليكات مع خيوط لمقاومة تقريبا. 60-80 MΩ. ينبغي غيض من الزجاج الكهربائي تكون طويلة وحادة. ملء غيض من القطب مع الحل 1 ٪ لوسيفر الأصفر عن طريق وضع القطب المعاكس مع نهاية غيض الكهربائي في الحل صفراء لوسيفر تقريبا. 30-60 ثانية. ثم الردم القطب مع LiCl 3M باستخدام حقنة هاميلتون ترك فقاعة الهواء بين الصبغة وLiCl. ربط كهربائي صبغة التعبئة لمرحلة الرأس.
- اضافة الى وجود كلوريد الفضة المطلية السلك الكهربائي في الأرض المالحة ومكان القطب صبغ fill فوق موازية يطير الى VNC باستخدام micromanipulator 3D الهيدروليكية. يجب أن تكون متصلا القطب صبغ ملء الى مكبر للصوت يسمح تمرير الحالية من أجل إطلاق سراح سلبا أو إيجابا الأصباغ المكلفة من القطب عن طريق تمرير المفرط أو depolarizing الحالية ، على التوالي.
- التبديل إلى العدسة مياه الغمر 40X وانخفاض غيض من القطب ملء صباغة على واحدة من GFS. وضع المحاور GF قريبة من السطح الظهري للسي. استخدام الأمام (نحو الرأس) لادخال حركة القطب في GF.
- تغير مصدر الضوء إلى الضوء epifluorescent والتبديل لتصفية صفراء لوسيفر. تطبيق تيار كهربائي hyperpolarizing لتعبئة صبغ مع مكبر للصوت لحقن صفراء لوسيفر في GF. يمكن التحكم بكمية حقن الصبغة التي ال(ه) من تمرير المبلغ الحالي وكذلك المدة يتم تمرير التيار. لمنع صبغة من سفك للخروج من موقع الحقن أو تلف GF ، ينصح باستخدام حقن الحالية المنخفضة (حوالي 3-5 غ) على مدى 1-5 دقائق.
- تطبيق الحالية حتى يمكن رؤية المحطة GF VNC بوضوح في الشكل (4A). عبر عن تلطيخ متشابك من الخلايا العصبية بعد المشبكي ، ومواصلة لتمرير الحالية حتى يوم ويمكن أيضا أن ينظر في صبغ الخلايا العصبية بعد المشبكي. إيقاف التيار الكهربائي وإزالة الصبغة التعبئة.
3. ممثل النتائج :
ويرد ممثل ملء صبغة واحدة مع GF صفراء لوسيفر في الشكل 4A. وقد حصلت على صورة بوصفها مكدس الصورة في عناصر البرنامج باستخدام كاميرا نيكون البقعة التي شنت على المجهر. في هذا التيار من خلال عينة صدر القطب لحوالي 2 دقيقة. يتم تعبئة شاملة للGF ويسمى كذلك محطة GF كبيرة في الصدر (الشكل 4A ، والقطع الناقص). أي الخلايا العصبية بعد المشبكي مرئية في هذه الحالة ، على الرغم من أن لوسيفر صفراء صغيرة بما يكفي لتمرير من خلال تقاطعات الفجوة. قد لا يتم إذا لم يتم حقن الصبغة طويلة بما فيه الكفاية في GF ثم يملأ عبر متشابك من الخلايا العصبية بعد المشبكي المشاهدة لأن إشارة ضعيفة جدا بحيث لا يمكن الكشف عنها. يمكن أن الخلايا العصبية بعد المشبكي للجزء (الشكل 4B ، ورؤساء السهم) تصور أكثر موثوق به استشفاف حتى أصغر الخلايا العصبية ، مثل Neurobiotin. حقن Neurobiotin 7 ٪ في 2 م حل أسيتات البوتاسيوم مع depolarizing الحالي لمدة 2 دقيقة كافية لتسمية الخلايا العصبية بعد المشبكي بقوة. ويمكن تصور أن يكون لNeurobiotin المجهري باستخدام مبائر Streptavidin بالإضافة إلى الأصباغ من موجات مختلفة. لأن Neurobiotin ليس صبغة الفلورسنت ، وشارك في حقن Rhodamin - ديكستران أو hydrazides اليكسا في نفس الحل ، يمكن استخدام الحقن لمراقبة الناجح في GF (الشكل 4C ، من Boerner وGodenschwege ، 2010 5).
الشكل 1. الرسم التخطيطي لذبابة النظر أفقيا. يتم عرض الصدر مع شق طولي لتصور الهياكل الداخلية. أثناء تشريح ، تم قطع العضلات الظهرية الرحلة طولية (DLMs ، أزرق) دون الإضرار الحبل البطني العصب (VNC ، عميق الحمراء) ، التي تقع الى العضلات البطنية الرحلة. القناة الهضمية (الخضراء) وتقع فوق VNC.
الشكل 2. رأي الظهرية من ذبابة تشريح. يتم وضع اثنين من المسامير وراء الرأس لموقف الطيران. دبابيس مثبتة من خلال عضلات الطيران (DLM) الاستمرار على فتح القفص الصدري. تم إزالة الأعضاء الداخلية لكشف الحبل البطني العصب (VNC).
الشكل 3. صبغ الإعداد التعبئة.
الشكل 4 ألف) Z - الإسقاط في الجزء الخلفي من فنك تعرض أحد GF صفراء مليئة وسيفر. وقد حصلت على صورة مباشرة بعد صبغ ملء مع كاميرا الفور. في الحيوانات البرية من نوع الجهاز الطرفي (بيضاوي) في القفص الصدري واضحة للعيان. ب) صورة متحد البؤر صبغة GF تمتلئ Neurobiotin في ذبابة من النوع البري. وصفت كل من جزء (سهام) والخلايا العصبية بعد المشبكي للجزء (رؤساء السهم). وكان تصور Neurobiotin مع Streptavidin بالإضافة إلى Cy3. C) صورة مليئة متحد البؤر البرية من نوع GFS مع Alexa555.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمكن تشريح الجهاز العصبي دون استخراج من الجسم يطير. هذا وقد اثنين من المزايا : أولا ، يسبب ضررا قليلا تشريح الجهاز العصبي ، والثانية ، ومعظم الأعصاب البقاء تعلق على العضلات والحواس. أداء التشريح ، كما هو موضح ، ويعد نموذج لوضع العلامات على التوالي إلى الأمام من صبغ GFS. مريح ، وبعد المشبكي للعصبونات حركية GFS البقاء تعلق على العضلات. المحاور ، وبالتالي فهي غير التالفة ، والحفاظ على الخلايا العصبية على قيد الحياة لفترة أطول. بالإضافة إلى ذلك ، الأضرار التي لحقت الجهاز العصبي ومن المرجح أن يعطل وظيفة مفترق الفجوة وبالتالي من المرجح أن تؤثر على فعالية عبر يملأ متشابك.
يمكن استخدامها لوسيفر صفراء ، ديكستران رودامين ، واليكسا الصوديوم الملح هيدرازيد فلور (Invitrogen) لحظة من التصور GF التشكل تحت المجهر الفلورسنت ، ولكن ينصح إشارة التضخيم باستخدام الأجسام المضادة الثانوية الفلورية للتصوير عالية الدقة مع المجهر مبائر 5. كلا لوسيفر صفراء ، فضلا عن Neurobiotin تسمية الخلايا بعد المشبكي عبر متشابك العابر يملأ مع Neurobiotin يجري أكثر موثوقية. ومع ذلك ، غير قابلة للNeurobiotin الفلورسنت ويتطلب حقن المناعية التالية وكذلك شارك في حقن صبغة الفلورسنت الثانية من أجل مراقبة حقن ناجحة.
وقد كان هذا أسلوب يستخدم بصورة روتينية لمقارنة مورفولوجية المحطات GF بين الأفراد من نفس النمط الجيني أو بين الأفراد من مختلف المورثات 5،6،7،8. بالإضافة ، يمكن أيضا أن مورفولوجية محطة متشابك تكون مرتبطة مع وظيفتها من خلال الحصول على تسجيلات من الدوائر الكهربية قبل تشريح بواسطة إجراءات موحدة 9،10.
أخيرا ، على الرغم من أن لدينا وسيلة التشريح أظهرت تعرض فقط VNC للحقن صبغة والتصوير المحطة GF ، وتشريح لاحقة من الدماغ من الكبسولة بعد حقن صبغة الرأس تسمح للتصوير لسوما GF والتشعبات في الدماغ وكذلك .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد المشروع وصفها من حيث عدد المنح R01HD050725 من المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية إلى العلامة المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية أو المعاهد الوطنية للصحة. نشكر أعضاء المختبر Godenschwege فضلا Schreader باربرا لمساهمتها في مخطوطة والفيديو.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | ||
| Dissection Microscope | AmScope | SM-2TZ | |
| Vannas Scissors Superfine | Academic Instruments | VS1023 | |
| Dumont Forceps Dumontstar 55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1mm |
| Borosilicate Glass Electrodes | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 | |
| Vertical Pipette Puller 700c | David Kopf Instruments | Model 700C | |
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma-Aldrich | L0259 | 1% in H2O |
| Fixed Stage Upright Microscope & Camera | Nikon Instruments | FN-1 & DS-U2 Camera | |
| Plan Fluor 10X Air Objective | Nikon Instruments | CFI Plan Fluor 10X NA 0.3 WD 16mm | |
| Fluor 40X water dipping Objective | Nikon Instruments | CFI Fluor 40X W NA 0.80 WD 2.0mm | |
| 3D hydraulic Micromanipulator | Narishige International | Model MW0-3 | |
| Amplifier | Getting Instruments, Inc. | Model 5A |
References
- Power, M. E. The thoracico-abdominal nervous system of an adult insect Drosophila melanogaster. J. Comp. Neurol. 88, 347-409 (1948).
- Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, T. A., Phelan, P. Making an escape: development and function of the Drosophila giant fibre system. Semin. Cell Dev. Biol. 17, 31-41 (2006).
- Boerner, J., Duch, C. Average shape standard atlas for the adult Drosophila ventral nerve cord. J. Comp. Neurol. 518, 2437-2455 (2010).
- Gu, H., O'Dowd, D. K. Cholinergic synaptic transmission in adult Drosophila Kenyon cells in sity. J. Neurosci. 26, 265-272 (2006).
- Boerner, J., Godenschwege, T. A. Application for the Drosophila ventral nerve cord standard in neuronal circuit reconstruction and in-depth analysis of mutant morphology. J. Neurogent. 24, 158-1567 (2010).
- Godenschwege, T. A., Kristiansen, L. V., Uthaman, S. B., Hortsch, M., Murphey, R. K. A conderved role for Drosophila Neuroglian and human L1-CAM in central-synapse formation. Curr. Biol. 16, 12-23 (2006).
- Uthaman, S. B., Godenschwege, T. A., Murphey, R. K. A mechanism distinct from highwire for the Drosophila ubiquitin conjugase bendless in synaptic growth and maturation. J. Neurosci. 28, 8615-8623 (2008).
- Storkebaum, E. Dominant mutations in the tyrosyl-tRNA synthetase gene recapitulate in Drosophila features of human Charcot-Marie-Tooth neuropathy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 11782-11787 (2009).
- Allen, M. J., Godenschwege, T. A. Electrophysiological recordings from the Drosophila giant fiber system (GFS). Cold Spring Harb. Protoc. 2010, pdb.prot5453-pdb.prot5453 (2010).
- Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster. J. Vis. Exp. , (2011).
