Summary
Een
Abstract
Het analyseren van de axonale en dendritische morfologie van neuronen, is het essentieel om het verkrijgen juiste etikettering van neuronale structuren. Goed voorbereid te zijn gelabeld monsters met weinig tot geen beschadiging van het weefsel stelt ons in staat celmorfologie te analyseren en aan de individuele monsters met elkaar te vergelijken, vandaar waardoor de identificatie van mutant afwijkingen.
In de aangetoonde methode dissectie van het zenuwstelsel blijft overwegend binnen de volwassen vlieg. Via een dorsale incisie, de buik en borstkas geopend en het merendeel van de interne organen zijn verwijderd. Alleen de dorsale zijde van de ventrale zenuw snoer (VNC) en de cervicale verbindende (CVC) met de grote axonen van de reus vezels (SBO) 1 worden blootgesteld, terwijl de hersenen met de GF cellichaam en dendrieten blijft 2 in de intacte kop . In deze voorbereiding de meeste zenuwen van de VNC moeten blijven gehecht aan hun spieren.
Na de dissectie, is de intracellulaire vullen van de reus vezel (GF) met een fluorescerende kleurstof gedemonstreerd. In de CVC de GF axonen bevinden zich op het dorsale oppervlak en kan dus eenvoudig worden gevisualiseerd onder een microscoop met differentieel interferentie contrast (DIC) optiek. Hierdoor kan de injectie van de GF axonen met kleurstof op deze site te labelen de gehele GF inclusief de axonen en hun terminals in de VNC. Deze methode resulteert in een betrouwbare en sterke kleuring van de SBO waardoor de neuronen direct worden afgebeeld na het vullen van een epifluorescerende microscoop. Als alternatief kan het fluorescerende signaal worden verbeterd met behulp van standaard immunohistochemie procedures 3 geschikt voor hoge resolutie confocale microscopie.
Protocol
1. Dissectie van de ventrale zenuw snoer
Dissectie en kleurstof vullen van de GF kan worden uitgevoerd bij kamertemperatuur. Voor alle dissectie stappen koud (4 ° C) zoutoplossing moet worden gebruikt om vertragen de celstofwisseling en langer houden de neuronen in leven.
- Verdoven volwassen vliegen (4 dagen of ouder) met CO 2 of chill ze op ijs totdat ze geïmmobiliseerd. Verlamming met ijs zal meer tijd nodig (tot 30 min), maar zorgt ervoor dat de vliegen geïmmobiliseerd langer.
- Plaats een vlieg in een Sylgard gecoate petrischaal. Deze dissectie vereist het gebruik van een sterke vergroting (80-100X) dissectie stereomicroscoop.
- Met Vannas schaar, verwijder benen, slurf, en vleugels.
- Gebruik grof en fijn pincet insect pennen (minutien pinnen) te oriënteren de vlieg dorsale zijde in de Sylgard schotel. Eerste pin van de buik en dan een beetje langwerpig het dier door het plaatsen van twee pinnen aan beide zijden van de nek, achter de kop, zodat de nek iets uitgerekt en toegankelijk is (zie figuur 2).
- Dompel de vlieg in verse, koude Drosophila zoutoplossing. De meest gebruikte Drosophila salines zijn voldoende voor de dissectie, maar wij hier een zoutoplossing beschreven in Gu en O'Dowd, 2006 4 gebruikt. Een luchtbel zal rond het vliegen. Verwijder de lucht met een spuit.
- Maak een korte, laterale incisie in de dorsale einde van de buik. Beginnend bij de incisie, maak een ondiepe, rechte snede langs de dorsale middellijn van de buik in de richting van de thorax. Ga dan verder de ondiepe, lengte gesneden in de thorax zo nauwkeurig mogelijk over de middellijn in de richting van het bindweefsel. Het is van cruciaal belang om de bezuinigingen ondiep om niet de VNC (figuur 1) schade.
- Gebruik twee mooie insect pinnen zorgvuldig te openen de thorax. Spreid het lichaam twee helften uit elkaar met behulp van de pinnen en plaats de pennen door de vlucht spieren (figuur 2). De thorax mag niet verder worden geopend als afgebeeld in de figuur 2 om te voorkomen dat het rippen van de cuticula. Om ervoor te zorgen een rechte oriëntatie van de VNC de pinnen moet worden geplaatst in dezelfde anterior posterior positie aan elke kant.
- Toegang tot de VNC voor dye injectie en een goede beeldvorming kan worden belemmerd door interne organen. Gebruik daarom tang en schaar om de maag, darmen, hart en de voortplantingsorganen te verwijderen. Trek de speekselklieren liggen aan beide zijden van de VNC. Zorgvuldig na te spoelen van de dissectie met verse zoutoplossing om drijvende weefsel en vet te verwijderen.
- Verwijder het vet lichaam van onder de cervicale verbindende (CVC). Het vet lichaam is het best zichtbaar bij een hoge vergrotingsfactor. Gebruik fijn pincet om het weefsel voorzichtig greep uit de kant en het eruit te trekken.
De ontleding kan worden uitgevoerd binnen 5 tot 10 minuten. Door het gebruik van vers, koud zout de ontleed, onbeschadigd zenuwstelsel zal in leven blijven voor ten minste een uur.
2. Intracellulaire GF te vullen
Het wordt aanbevolen om de kleurstof te vullen zo snel mogelijk na de dissectie uit te voeren.
- Plaats de schotel met de Sylgard ontleed vliegen onder een microscoop rechtop met een vaste fase (Figuur 3) en een 10x lucht doelstelling. Midden van het monster met het achterste einde van de vlieg gepositioneerd in de richting van de kleurstof te vullen elektrode houder. Gebruik het differentieel interferentie contrast (DIC) modus en richten zich op de CVC. De grote axonen van de SBO moet duidelijk zichtbaar zijn op het dorsale oppervlak van de CVC.
- Verdunnen Lucifer Yellow CH dilithium zout in gedeïoniseerd H2O tot een concentratie van 1%. Trek een borosilicaatglas elektrode met gloeidraad met een weerstand van ca.. 60-80 MΩ. De tip van de glaselektrode moet lang en scherp. Vul de tip van de elektrode met 1% Lucifer Yellow oplossing door het plaatsen van de elektrode met het uiteinde tegenover de punt van de elektrode in de Lucifer Yellow oplossing voor ca.. 30-60 seconden. Dan backfill de elektrode met 3M LiCl met behulp van een injectiespuit Hamilton verlaten van een luchtbel tussen de kleurstof en LiCl. Sluit de kleurstof te vullen elektrode op het hoofd podium.
- Plaats een chloride gecoate zilverdraad massa-elektrode in de zoute en plaats de kleurstof vult elektrode boven de vliegen parallel aan de VNC met behulp van een 3D-hydraulische micromanipulator. De kleurstof gevuld elektrode moet worden aangesloten op een versterker die het mogelijk maakt het passeren van stroom in om negatief of positief geladen kleurstoffen los van de elektrode door het passeren hyper-of depolariserende stroom, respectievelijk.
- Schakel over naar een 40x lens onderdompeling in water en laat de punt van de kleurstof te vullen elektrode op een van de SBO. De GF axonen liggen dicht bij het dorsale oppervlak van de CVC. Gebruik een vooruit (in de richting van het hoofd) verplaatsing naar de elektrode te voegen in de GF.
- Verander je lichtbron epifluorescerende licht en overschakelen naar een Lucifer Yellow filter. Breng een hyperpolarizing stroom naar de kleurstof te vullen elektrode met de versterker naar de Lucifer Yellow injecteren in de GF. De hoeveelheid kleurstof ingespoten kan worden gecontroleerd door ee hoeveelheid stroom doorgegeven, alsmede de duur van de huidige wordt doorgegeven. Om te voorkomen dat de kleurstof van morsen uit de injectieplaats of beschadiging van de GF, is het aanbevolen om te injecteren met behulp van een lage stroom (ca. 3-5 nA) over 1-5 minuten.
- Van toepassing zijn huidige tot de GF-terminal in de VNC is duidelijk te zien (Figuur 4A). Voor de trans-synaptische kleuring van postsynaptische neuronen, blijven de huidige door te geven totdat kleurstof kan ook worden gezien in postsynaptische neuronen. Schakel de stroom uit en verwijder de kleurstof te vullen elektrode.
3. Representatieve resultaten:
Een vertegenwoordiger kleurstof te vullen voor een GF met Lucifer Geel is weergegeven in figuur 4A. Het beeld werd verkregen als een afbeelding stapel in Nikon Elements software met behulp van een plek camera gemonteerd op de microscoop. In deze steekproef stroom werd door de elektrode voor ongeveer 2 minuten. De GF is goed gevuld en de grote GF-terminal in de borstkas is goed gelabeld (Figuur 4A, ellips). Geen postsynaptische neuronen zichtbaar zijn in dit geval, hoewel Lucifer Yellow is klein genoeg om door gap junctions. Als de kleurstof is niet lang genoeg is geïnjecteerd in de GF dan trans-synaptische vult van de postsynaptische neuronen kunnen niet gezien omdat het signaal te zwak is om te worden gedetecteerd. Neuronen postsynaptische aan de GFS (Figuur 4B, pijlpunten) kunnen meer betrouwbaar kan worden gevisualiseerd met behulp van nog kleiner neuronale tracers, zoals Neurobiotin. Injecteren van een 7% Neurobiotin in 2 M kaliumacetaat oplossing met een depolariserende stroom voor twee minuten is voldoende om sterk label postsynaptische neuronen. Neurobiotin kan gevisualiseerd worden voor het gebruik van confocale microscopie Streptavidine gekoppeld aan kleurstoffen van verschillende golflengten. Omdat Neurobiotin is niet een fluorescente kleurstof, co-injectie van Rhodamin-Dextran of Alexa hydraziden in dezelfde oplossing, kan gebruikt worden om een succesvolle injectie monitor in de GF (Figuur 4C, uit Boerner en Godenschwege, 2010 5).
Figuur 1. Schematische tekening van een vlieg zijdelings bekeken. De thorax wordt weergegeven met een longitudinale incisie aan de interne structuren te visualiseren. Tijdens de dissectie, werden de dorsale longitudinale vliegspieren (DLMS, blauw) snijden zonder beschadiging van het ventrale zenuw koord (VNC, diep rood), dat ligt ventraal van de vlucht spieren. De darm (groen) ligt boven de VNC.
Figuur 2. Dorsaal weergave van een ontleed vliegen. Twee pinnen zijn geplaatst achter het hoofd naar de vlieg positie. De pennen aangebracht door de vlucht spieren (DLM) houd de thorax te openen. Interne organen werden verwijderd om het ventrale zenuw kabel (VNC) bloot te leggen.
Figuur 3. Dye te vullen setup.
Figuur 4. A) Z-projectie van het achterste deel van de VNC met een GF gevuld met Lucifer Yellow. Het beeld werd verworven onmiddellijk na kleurstof vullen met een spot camera. In wild-type dieren van de terminal (ellips) in de thorax is duidelijk zichtbaar. B) Confocale beeld van een GF kleurstof vullen met Neurobiotin in een wild-type vliegen. Zowel GFS (pijlen) en neuronen postsynaptische aan de GFS (pijlpunten) zijn gelabeld. Neurobiotin werd gevisualiseerd met streptavidine gekoppeld aan Cy3. C) Confocale beeld van de wild-type GFS gevuld met Alexa555.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het zenuwstelsel kan worden ontleed zonder extraheren uit de vlieg lichaam. Dit heeft twee voordelen, ten eerste de dissectie veroorzaakt weinig schade aan het zenuwstelsel, en ten tweede, de meeste zenuwen aangesloten blijven op de spieren en de zintuigen. Het uitvoeren van de dissectie, zoals beschreven, bereidt het monster voor rechttoe rechtaan dye-etikettering van de SBO. Handig is dat de motoneuronen postsynaptische om de GFS aangesloten blijven op de spieren. Axonen, dus onbeschadigd zijn, houden van de neuronen in leven langer. Daarnaast is schade aan het zenuwstelsel is waarschijnlijk gap junction functioneren verstoren en is dus waarschijnlijk de effectiviteit van de trans-synaptische vult beïnvloeden.
Lucifer Geel, Rhodamine dextran, en Alexa Fluor hydrazide natriumzout (Invitrogen) kan worden gebruikt voor onmiddellijke weergave van de GF morfologie onder een fluorescentie microscoop, maar het signaal amplificatie met behulp van fluorescerende antilichamen secundaire worden aanbevolen voor hoge resolutie imaging met een confocale microscoop 5. Beide, Lucifer Yellow evenals Neurobiotin het label van de postsynaptische cellen via trans-synaptische vult, met Neurobiotin dat het veel betrouwbaarder. Echter, Neurobiotin is niet-fluorescerende en vereist immunohistochemie na injectie en de co-injectie van een seconde fluorescerende kleurstof in om een succesvolle injectie monitor.
Deze techniek is routinematig gebruikt om de morfologie van de GF klemmen tussen individuen van eenzelfde genotype of tussen individuen van verschillende genotypen 5,6,7,8 vergelijken. Daarnaast kan de morfologie van de synaptische terminal ook worden gecorreleerd met zijn functie door het verkrijgen van elektrofysiologische opnames van het circuit voorafgaand aan de dissectie door standaard procedures 9,10.
Ten slotte zou hoewel onze aangetoond dissectiemethode alleen blootgesteld de VNC voor dye-injectie en beeldvorming van de GF-terminal, een latere dissectie van de hersenen van het hoofd capsule na kleurstof injectie zorgen voor beeldvorming van de GF soma en dendrieten in de hersenen ook .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Het beschreven project werd ondersteund door Grant nummer R01HD050725 van het National Institute of Child Health and Human Development aan TAG De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van het National Institute of Child Health and Human Development of de National Institutes of Health. Wij danken de leden van de Godenschwege lab als Barbara Schreader voor hun inbreng aan het manuscript en video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | ||
| Dissection Microscope | AmScope | SM-2TZ | |
| Vannas Scissors Superfine | Academic Instruments | VS1023 | |
| Dumont Forceps Dumontstar 55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1mm |
| Borosilicate Glass Electrodes | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 | |
| Vertical Pipette Puller 700c | David Kopf Instruments | Model 700C | |
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma-Aldrich | L0259 | 1% in H2O |
| Fixed Stage Upright Microscope & Camera | Nikon Instruments | FN-1 & DS-U2 Camera | |
| Plan Fluor 10X Air Objective | Nikon Instruments | CFI Plan Fluor 10X NA 0.3 WD 16mm | |
| Fluor 40X water dipping Objective | Nikon Instruments | CFI Fluor 40X W NA 0.80 WD 2.0mm | |
| 3D hydraulic Micromanipulator | Narishige International | Model MW0-3 | |
| Amplifier | Getting Instruments, Inc. | Model 5A |
References
- Power, M. E. The thoracico-abdominal nervous system of an adult insect Drosophila melanogaster. J. Comp. Neurol. 88, 347-409 (1948).
- Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, T. A., Phelan, P. Making an escape: development and function of the Drosophila giant fibre system. Semin. Cell Dev. Biol. 17, 31-41 (2006).
- Boerner, J., Duch, C. Average shape standard atlas for the adult Drosophila ventral nerve cord. J. Comp. Neurol. 518, 2437-2455 (2010).
- Gu, H., O'Dowd, D. K. Cholinergic synaptic transmission in adult Drosophila Kenyon cells in sity. J. Neurosci. 26, 265-272 (2006).
- Boerner, J., Godenschwege, T. A. Application for the Drosophila ventral nerve cord standard in neuronal circuit reconstruction and in-depth analysis of mutant morphology. J. Neurogent. 24, 158-1567 (2010).
- Godenschwege, T. A., Kristiansen, L. V., Uthaman, S. B., Hortsch, M., Murphey, R. K. A conderved role for Drosophila Neuroglian and human L1-CAM in central-synapse formation. Curr. Biol. 16, 12-23 (2006).
- Uthaman, S. B., Godenschwege, T. A., Murphey, R. K. A mechanism distinct from highwire for the Drosophila ubiquitin conjugase bendless in synaptic growth and maturation. J. Neurosci. 28, 8615-8623 (2008).
- Storkebaum, E. Dominant mutations in the tyrosyl-tRNA synthetase gene recapitulate in Drosophila features of human Charcot-Marie-Tooth neuropathy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 11782-11787 (2009).
- Allen, M. J., Godenschwege, T. A. Electrophysiological recordings from the Drosophila giant fiber system (GFS). Cold Spring Harb. Protoc. 2010, pdb.prot5453-pdb.prot5453 (2010).
- Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster. J. Vis. Exp. , (2011).
