Summary
एक
Abstract
न्यूरॉन्स की axonal और वृक्ष के समान आकारिकी का विश्लेषण करने के लिए, यह आवश्यक है neuronal संरचनाओं के सटीक लेबलिंग प्राप्त है. कोई ऊतकों को नुकसान के लिए थोड़ा के साथ अच्छी तरह से लेबल के नमूने की तैयारी हमें सेल आकारिकी का विश्लेषण करने के लिए और एक दूसरे से व्यक्तिगत नमूनों की तुलना में सक्षम बनाता है, इसलिए उत्परिवर्ती विसंगतियों की पहचान की अनुमति.
प्रदर्शन विच्छेदन विधि में तंत्रिका तंत्र ज्यादातर वयस्क मक्खी के अंदर रहता है. चीरा के माध्यम से एक पृष्ठीय, पेट और छाती खोले जाते हैं और आंतरिक अंगों का सबसे को हटा रहे हैं. केवल उदर तंत्रिका कॉर्ड (VNC) और गर्भाशय ग्रीवा (सीवीसी) संयोजी विशाल (GFS) फाइबर 1 की बड़ी axons युक्त पृष्ठीय पक्ष उजागर, कर रहे हैं जबकि GF सेल शरीर और dendrites युक्त मस्तिष्क बरकरार सिर में 2 रहता है . और इस तैयारी में VNC के सबसे नसों अपनी मांसपेशियों को संलग्न रहना चाहिए.
विच्छेदन के बाद, एक फ्लोरोसेंट रंजक के साथ विशाल फाइबर (GF) के intracellular भरने का प्रदर्शन है. सीवीसी GF axons पृष्ठीय सतह पर स्थित हैं और इस प्रकार अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) प्रकाशिकी के साथ एक खुर्दबीन के नीचे आसानी से देखे जा सकते हैं. यह इस साइट पर GF axons की डाई के साथ इंजेक्शन VNC और axons और उनके टर्मिनल सहित पूरे GF लेबल करने की अनुमति देता है. इस विधि GFS का विश्वसनीय और मजबूत धुंधला अनुमति न्यूरॉन्स एक epifluorescent खुर्दबीन के साथ भरने के बाद तुरंत imaged में परिणाम है. वैकल्पिक रूप से, फ्लोरोसेंट संकेत मानक immunohistochemistry 3 प्रक्रियाओं के उच्च संकल्प confocal माइक्रोस्कोपी के लिए उपयुक्त का उपयोग बढ़ाया जा सकता है है.
Protocol
1. उदर तंत्रिका कॉर्ड के विच्छेदन
विच्छेदन और डाई GF के भरने कमरे के तापमान पर किया जा सकता है. सभी विच्छेदन ठंड कदम (4 डिग्री सेल्सियस) खारा नीचे सेल चयापचय धीमी और न्यूरॉन्स जीवित अब रख किया जाना चाहिए.
- सीओ 2 के साथ वयस्क मक्खियों (4 दिनों या पुराने) anesthetize या उन्हें बर्फ पर ठंड जब तक वे स्थिर हैं . बर्फ के साथ Anesthetizing अधिक समय (30 मिनट) की आवश्यकता होती है, लेकिन अब के लिए स्थिर मक्खियों रखेंगे.
- एक Sylgard लेपित पेट्री डिश प्लेस में एक मक्खी. यह विच्छेदन के एक उच्च (80-100X) विच्छेदन बढ़ाई stereomicroscope के उपयोग की आवश्यकता है.
- Vannas कैंची के साथ, पैर, सूंड और पंखों को हटा दें.
- उन्मुख करने के लिए मोटे संदंश और ठीक कीट पिन (minutien पिन) Sylgard पकवान में मक्खी पृष्ठीय पक्ष का उपयोग करें. पेट पहली बार पिन और फिर जानवर गर्दन के प्रत्येक पक्ष पर दो पिनों रखने, सिर के पीछे इतना है कि गर्दन थोड़ा और फैला है सुलभ (देखें चित्र 2) थोड़ा बढ़ाना.
- ताजा, ठंड ड्रोसोफिला खारा डूब में मक्खी. सबसे अधिक इस्तेमाल किया ड्रोसोफिला salines विच्छेदन के लिए पर्याप्त है, लेकिन यहाँ हम गुजरात और O'Dowd में वर्णित खारा, 4 २,००६ का इस्तेमाल कर रहे हैं. एक हवाई बुलबुले मक्खी चारों ओर जाएगा. एक सिरिंज के साथ हवा निकालें.
- पेट की पृष्ठीय अंत में एक छोटी, पार्श्व चीरा बनाओ. चीरा पर शुरू, छाती की ओर पेट के पृष्ठीय midline के साथ एक उथले, सीधे कट कर. फिर उथले, ठीक के रूप में संभव के रूप में छाती में अनुदैर्ध्य संयोजी ओर midline साथ कटौती जारी है. यह कटौती उथले VNC (चित्रा 1) के रूप में नुकसान नहीं बनाने के लिए महत्वपूर्ण है.
- ध्यान से छाती को खोलने के दो ठीक कीट पिन का उपयोग करें. शरीर के अलावा आधा पिन का उपयोग कर बिखरा हुआ है और उड़ान की मांसपेशियों (चित्रा 2) के माध्यम से पिन की जगह. छाती आगे खोला नहीं जा के रूप में चित्र 2 छल्ली के तेजस्वी से बचने में दर्शाया जाना चाहिए. VNC के एक सीधे ओरिएंटेशन सुनिश्चित करने के पिंस एक ही प्रत्येक पक्ष पर पूर्वकाल पीछे की स्थिति में रखा जाना चाहिए.
- डाई इंजेक्शन और उचित इमेजिंग के लिए VNC तक पहुंच आंतरिक अंगों द्वारा बाधित हो सकता है. इसलिए, संदंश और कैंची का उपयोग करने के लिए पेट, आंत, हृदय, और प्रजनन अंगों को निकालने के. लार ग्रंथियों VNC के दोनों पक्षों पर झूठ बोल खींचो. ताजा करने के लिए अस्थायी ऊतक और वसा को हटाने के लिए नमक के साथ विच्छेदन ध्यान से कुल्ला.
- गर्भाशय ग्रीवा के संयोजी (सीवीसी) के नीचे से वसा शरीर निकालें. वसा शरीर के एक उच्च वृद्धि पर सबसे अच्छा दिखाई देता है. ओर से ध्यान ऊतकों को समझ और इसे बाहर खींच ठीक संदंश का प्रयोग करें.
विच्छेदन 5 से 10 मिनट के भीतर किया जा सकता है है. ताजा, ठंड खारा का उपयोग करके dissected, undamaged तंत्रिका तंत्र में कम से कम एक घंटे के लिए जीवित रहेगा.
2. Intracellular GF को भरने के
यह विच्छेदन के बाद जितनी जल्दी हो सके भरने डाई करने की सिफारिश की है.
- एक निश्चित (चित्रा 3) मंच और एक 10x हवा के उद्देश्य के साथ एक ईमानदार खुर्दबीन के नीचे dissected मक्खी के साथ Sylgard पकवान प्लेस. केंद्र डाई भरण इलेक्ट्रोड धारक की ओर तैनात मक्खी के पीछे के अंत के साथ नमूना. अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) और सीवीसी पर मोड ध्यान केंद्रित का उपयोग करें. GFS का बड़ा axons सीवीसी की पृष्ठीय सतह पर स्पष्ट रूप से दिखाई जानी चाहिए.
- विआयनीकृत 1% की एकाग्रता के लिए H2O में लूसिफ़ेर पीला दर्पण dilithium नमक पतला. लगभग एक प्रतिरोध करने के लिए फिलामेंट के साथ एक Borosilicate कांच इलेक्ट्रोड खींचो. 60-80 MΩ. ग्लास इलेक्ट्रोड की नोक लंबी और तेज होना चाहिए. 1% लूसिफ़ेर पीला समाधान के साथ अंत के साथ के लिए लगभग लूसिफ़ेर पीला समाधान में इलेक्ट्रोड टिप विपरीत इलेक्ट्रोड रखकर इलेक्ट्रोड की नोक भरें. 30-60 सेकंड. फिर एक हैमिल्टन डाई और LiCl के बीच एक हवाई बुलबुले छोड़ने सिरिंज का उपयोग कर 3M LiCl के साथ इलेक्ट्रोड backfill. डाई सिर चरण को भरने के इलेक्ट्रोड कनेक्ट.
- खारा में क्लोराइड लेपित चांदी के तार जमीन इलेक्ट्रोड डालें और डाई मक्खी समानांतर ऊपर भरण VNC इलेक्ट्रोड एक 3 डी हाइड्रोलिक micromanipulator का उपयोग जगह. डाई भरने के इलेक्ट्रोड है कि आदेश में वर्तमान पारित करने के लिए इलेक्ट्रोड से नकारात्मक या सकारात्मक चार्ज रंजक अति या गुजर depolarizing वर्तमान क्रमशः द्वारा जारी की अनुमति देता है एक एम्पलीफायर से जुड़ा होना चाहिए.
- एक 40x पानी विसर्जन लेंस के लिए स्विच और एक GFS के पर डाई भरण इलेक्ट्रोड की टिप कम. GF axons सीवीसी की पृष्ठीय सतह के करीब रखना. GF में इलेक्ट्रोड डालने के आगे आंदोलन (सिर की ओर) का प्रयोग करें.
- Epifluorescent प्रकाश करने के लिए अपने प्रकाश स्रोत बदलें और एक लूसिफ़ेर पीला फिल्टर करने के लिए स्विच. एक GF में लूसिफ़ेर पीला इंजेक्षन एम्पलीफायर के साथ hyperpolarizing डाई भरने के इलेक्ट्रोड के लिए वर्तमान लागू करें. डाई इंजेक्ट की मात्रा वें द्वारा नियंत्रित किया जा सकता हैई राशि की मौजूदा अवधि वर्तमान पारित कर दिया है के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पारित कर दिया. इंजेक्शन साइट या क्षति GF के बाहर spilling से डाई को रोकने के लिए, यह 1-5 मिनट पर एक कम वर्तमान (लगभग 3-5) का उपयोग इंजेक्षन करने के लिए सिफारिश की है.
- वर्तमान लागू VNC में GF टर्मिनल तक स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है (चित्रा -4 ए). Postsynaptic न्यूरॉन्स के पार synaptic धुंधला के लिए, जब तक डाई postsynaptic न्यूरॉन्स में भी देखा जा सकता है पर वर्तमान गुजारें जारी है. बंद वर्तमान स्विच और डाई भरण इलेक्ट्रोड हटायें.
3. प्रतिनिधि परिणाम:
एक प्रतिनिधि डाई लूसिफ़ेर पीला साथ एक GF के लिए भरने चित्रा -4 ए में दिखाया गया है. छवि Nikon तत्वों सॉफ्टवेयर में एक छवि ढेर एक जगह खुर्दबीन पर घुड़सवार कैमरे का उपयोग कर के रूप में अधिग्रहण कर लिया था. वर्तमान में इस नमूने के बारे में 2 मिनट के लिए इलेक्ट्रोड के माध्यम से पारित किया गया था. GF और अच्छी तरह से भर जाता है और छाती में बड़ी GF टर्मिनल अच्छी तरह से लेबल है (4A चित्रा, अंडाकार). कोई postsynaptic न्यूरॉन्स इस मामले में दिखाई दे रहे हैं, हालांकि लूसिफ़ेर पीला काफी छोटे अंतराल जंक्शनों के माध्यम से पारित है. यदि डाई GF में काफी लंबे समय के इंजेक्शन नहीं है तो postsynaptic न्यूरॉन्स की पार synaptic भरता है क्योंकि संकेत भी कमजोर है पता लगाया जा रहा नहीं देखा जा सकता है. GFS (चित्रा 4B, तीर सिर) के लिए postsynaptic न्यूरॉन्स अधिक मज़बूती visualized किया जा सकता है भी छोटे Neurobiotin जैसे neuronal tracers, का उपयोग. इंजेक्शन से 2 मिनट के लिए एक depolarizing वर्तमान के साथ 2 एम पोटेशियम एसीटेट समाधान में एक 7% Neurobiotin postsynaptic न्यूरॉन्स जोरदार लेबल करने के लिए पर्याप्त है. Neurobiotin confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग विभिन्न तरंगदैर्य के रंगों से मिलकर streptavidin के लिए visualized किया जा सकता है. क्योंकि Neurobiotin एक फ्लोरोसेंट डाई नहीं है, Rhodamin Dextran या एक ही समाधान में Alexa hydrazides सह इंजेक्शन, GF (चित्रा 4C, Boerner और Godenschwege से 5, 2010) में एक सफल इंजेक्शन की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
चित्रा 1 एक मक्खी की योजनाबद्ध ड्राइंग laterally देखा जा सकता है. छाती आंतरिक संरचना कल्पना एक अनुदैर्ध्य चीरा के साथ प्रदर्शित किया जाता है. विच्छेदन के दौरान, पृष्ठीय अनुदैर्ध्य उड़ान की मांसपेशियों (DLMs नीला) उदर तंत्रिका कॉर्ड (VNC, गहरे लाल रंग), जो उड़ान की मांसपेशियों को उदर झूठ को नुकसान पहुँचाए बिना काट रहे थे. पेट (हरा) VNC के ऊपर है.
चित्रा 2 एक विच्छेदित मक्खी के पृष्ठीय दृश्य. दो पिन के सिर के पीछे रखा जाता है के लिए उड़ान भरने की स्थिति है. उड़ान की मांसपेशियों (DLM) के माध्यम से चिपका पिन छाती खुला पकड़. आंतरिक अंगों को उदर तंत्रिका कॉर्ड (VNC) का पर्दाफाश करने के लिए हटा दिया गया.
चित्रा 3 डाई भरण सेटअप.
चित्रा 4) Z VNC के पीछे भाग एक लूसिफ़ेर पीला के साथ भरा GF दिखाने के प्रक्षेपण . छवि डाई एक स्थान कैमरा के साथ भरने के तुरंत बाद अधिग्रहण कर लिया था. जंगली प्रकार के पशुओं में छाती में टर्मिनल (दीर्घवृत्त) स्पष्ट रूप से दिखाई देता है. बी) एक GF डाई के Confocal छवि Neurobiotin साथ जंगली प्रकार एक मक्खी में भरने. दोनों GFS (तीर) और postsynaptic न्यूरॉन्स GFS (तीर सिर) का लेबल रहे हैं. Neurobiotin कल्पना के साथ streptavidin Cy3 मिलकर. सी) जंगली प्रकार GFS Confocal छवि Alexa555 से भरा.
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Discussion
तंत्रिका तंत्र यह मक्खी के शरीर से निकालने के बिना dissected किया जा सकता है है. इससे दो फायदे है, पहली बार, विच्छेदन तंत्रिका तंत्र के लिए थोड़ा नुकसान का कारण बनता है, और दूसरा, सबसे नसों रहने के मांसपेशियों और संवेदी अंगों से जुड़ी. विच्छेदन, के रूप में वर्णित, प्रदर्शन सीधे आगे GFS डाई लेबलिंग के लिए नमूना तैयार करता है. सुविधा, GFS के लिए postsynaptic motoneurons मांसपेशियों को जुड़े रहने. Axons, इसलिए, undamaged हैं, अब न्यूरॉन्स जीवित रखते हुए. इसके अलावा, तंत्रिका तंत्र को नुकसान के अंतराल जंक्शन समारोह बाधित होने की संभावना है और इस तरह पार synaptic भरता प्रभावकारिता प्रभावित होने की संभावना है.
लूसिफ़ेर पीला, rhodamine dextran और एलेक्सा Fluor hydrazide सोडियम नमक (Invitrogen) एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के तहत GF आकारिकी के त्वरित दृश्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन संकेत प्रवर्धन माध्यमिक फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी का उपयोग कर एक confocal खुर्दबीन 5 के साथ उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए सिफारिश कर रहे हैं. दोनों, लूसिफ़ेर के रूप में Neurobiotin लेबल के रूप में अच्छी तरह पीला पार synaptic postsynaptic कोशिकाओं के माध्यम से Neurobiotin जा रहा है और अधिक विश्वसनीय के साथ भरता है. हालांकि, Neurobiotin गैर फ्लोरोसेंट और immunohistochemistry निम्नलिखित के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक दूसरे फ्लोरोसेंट रंजक के सह इंजेक्शन इंजेक्शन की आवश्यकता है क्रम में एक सफल इंजेक्शन की निगरानी.
इस तकनीक को नियमित किया गया है इसी जीनोटाइप के व्यक्तियों के बीच या अलग 5,6,7,8 जीनोटाइप के व्यक्तियों के बीच GF टर्मिनलों की आकारिकी की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया. इसके अलावा, synaptic टर्मिनल के morphology भी मानक 9,10 प्रक्रियाओं द्वारा विच्छेदन के लिए पहले सर्किट से electrophysiological रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के द्वारा अपने कार्य के साथ कर सकते हैं सहसंबद्ध किया जा.
अंत में, हालांकि हमारे प्रदर्शन विच्छेदन विधि केवल डाई इंजेक्शन और GF टर्मिनल, डाई इंजेक्शन के बाद सिर कैप्सूल से मस्तिष्क के बाद विच्छेदन की इमेजिंग के लिए VNC उजागर GF सोम इमेजिंग और के रूप में अच्छी तरह से मस्तिष्क में dendrites के लिए अनुमति होगी .
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
वर्णित परियोजना अनुदान संख्या R01HD050725 द्वारा नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ बाल स्वास्थ्य और मानव विकास से समर्थित किया गया था करने के लिए टैग के लिए सामग्री केवल लेखकों की ज़िम्मेदारी है और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ बाल स्वास्थ्य और मानव विकास या की आधिकारिक विचार जरूरी नहीं प्रतिनिधित्व करते हैं स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान. हम अपनी पांडुलिपि और वीडियो इनपुट के लिए Godenschwege के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रयोगशाला बारबरा Schreader के सदस्यों को धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | ||
| Dissection Microscope | AmScope | SM-2TZ | |
| Vannas Scissors Superfine | Academic Instruments | VS1023 | |
| Dumont Forceps Dumontstar 55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1mm |
| Borosilicate Glass Electrodes | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 | |
| Vertical Pipette Puller 700c | David Kopf Instruments | Model 700C | |
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma-Aldrich | L0259 | 1% in H2O |
| Fixed Stage Upright Microscope & Camera | Nikon Instruments | FN-1 & DS-U2 Camera | |
| Plan Fluor 10X Air Objective | Nikon Instruments | CFI Plan Fluor 10X NA 0.3 WD 16mm | |
| Fluor 40X water dipping Objective | Nikon Instruments | CFI Fluor 40X W NA 0.80 WD 2.0mm | |
| 3D hydraulic Micromanipulator | Narishige International | Model MW0-3 | |
| Amplifier | Getting Instruments, Inc. | Model 5A |
References
- Power, M. E. The thoracico-abdominal nervous system of an adult insect Drosophila melanogaster. J. Comp. Neurol. 88, 347-409 (1948).
- Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, T. A., Phelan, P. Making an escape: development and function of the Drosophila giant fibre system. Semin. Cell Dev. Biol. 17, 31-41 (2006).
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