Summary
Abstract
뉴런의 axonal와 돌기 형태를 분석하기 위해서는의 연결 구조의 정확한 라벨을 얻기 위해 필수적입니다. 노 조직 손상이 거의 잘 레이블 샘플을 준비하는 것은 그러므로 돌연변이 변이의 식별을 허용, 우리는 세포 형태를 분석하고 서로에게 개별 샘플을 비교할 수 있습니다.
시연 절개 방법에서 신경 시스템은 성인 플라이 내부에 대부분 남아있다. 지느러미 절개를 통해 복부와 흉부 열리고 있으며, 대부분의 내부 장기가 제거됩니다. GF 셀 본문과 dendrites을 포함하고있는 두뇌 손상 머리에이 남아있는 동안 복부 신경 코드 (VNC)와 거대한 섬유 (GFS) 1의 큰 axons를 포함하는 자궁 결합 (CVC)의 단지 등의 측면이 노출 . 이 준비에서 VNC 대부분의 신경들은 근육에 연결되어 유지됩니다.
해부 다음, 형광 염료와 함께 거대한 섬유 (GF)의 세포내 작성이 증명됩니다. CVC에서는 GF의 axons는 등의 표면에 위치하고 있으며 따라서 차등 간섭 대비 (DIC) 광학 장치와 현미경으로 쉽게 시각하실 수 있습니다. 이것은이 사이트에서 염료와 GF의 axons의 주입은 VNC에서 axons과 단말기를 포함한 전체 GF 레이블을 수 있습니다. 이 방법은 신경이 epifluorescent 현미경으로 기입 후 즉시 군데 수 있도록 GFS의 안정적이고 강력한 얼룩을 초래합니다. 또는 형광 신호는 높은 해상도 공촛점 현미경에 적합한 표준 immunohistochemistry 절차 3을 사용 강화 수 있습니다.
Protocol
1. 복부 신경 코드의 해부
GF의 필링 해부와 염료는 실온에서 수행할 수 있습니다. 모든 해부는 추운 단계 (4 ° C) 호수가 세포 신진 대사를 느리게하고 더 이상 신경이 살아 유지하는 데 사용해야합니다.
- CO 2와 함께 성인 파리 (4 일간 이상)을 마취하거나 그들이 움직일 때까지 얼음에 그들을 진정. 얼음 Anesthetizing 것은 더 많은 시간을 (최대 30 분)이 필요합니다하지만, 이상에 대한 고정 파리를 유지합니다.
- Sylgard 코팅 페트리 접시에 놓으세요 날아. 이것은 절개는 높은 배율 (80 - 100X) 절개의 stereomicroscope의 사용을 필요로합니다.
- Vannas 가위와 다리, 코, 그리고 날개를 제거합니다.
- Sylgard 요리의 방향으로 비행 등의 측면을 거친 포셉과 훌륭한 곤충 핀 (minutien 핀)을 최대 사용합니다. 먼저 복부를 핀 후 목을 약간 (그림 2 참조) 늘어 및 액세스할 수 있도록, 머리 뒤쪽, 목 양쪽에 두 개의 핀을 배치하여 약간 동물을 연장하다.
- 신선하고 차가운 Drosophila의 호수에서 날아 잠수함. 가장 일반적으로 사용되는 Drosophila의 살린스는 절개를 위해, 그러나 여기서 우리가 구 및오다에 설명된 생리 2006 년 4 사용 충분합니다. 기포가 파리를 둘러싸고있는 것입니다. 주사기로 공기를 제거합니다.
- 복부의 지느러미 끝에 짧은 수평 절개를합니다. 절개에서 시작, 흉부으로 복부의 지느러미 정중선을 따라 얕은, 직선 절단합니다. 다음 결합 방향으로 정중선을 따라 정확하게 최대한 흉부에있는 얕은, 세로 절단을 계속합니다. 이것은 VNC (그림 1)을 손상하지로 인하 얕은하기 위해 중요합니다.
- 조심스럽게 흉부를 열고 두 미세 곤충 핀을 사용합니다. 몸이 핀을 사용하여 분리 반쪽 확산 및 비행 근육 (그림 2)을 통해 핀을 놓습니다. 표피의 추출 방지하기 위해 그림 2에서 묘사된 것처럼 흉부는 더 이상 열 수 없습니다. VNC의 직선 방향을 보장하기 위해 핀은 양쪽에 동일한 앞쪽에 후부 위치에 배치되어야합니다.
- 염료 주입 적절한 영상을위한 VNC에 대한 액세스가 내장 의해 가려지지 수 있습니다. 따라서, 위, 창자, 심장, 그리고 생식기를 제거하는 집게와 가위를 사용합니다. VNC의 양쪽에 누워있는 침샘을 빼낸다. 부동 조직과 지방을 제거하는 새로운 식염수에 조심스럽게 절개를 씻어.
- 자궁 경부 결합 (CVC) 아래에서 지방 시신을 제거합니다. 지방 몸은 높은 배율에서 가장 볼 수 있습니다. 주의 측면에서 조직을 파악하고 그것을 잡아 좋은 포셉를 사용합니다.
절개는 5~10분 이내에 수행할 수 있습니다. 신선한 차가운 호수를 사용하여 해부, 손상 신경 시스템은 적어도 하나의 시간 동안 살아 남아있게됩니다.
2. 세포내 GF 작성
이것은 절개 후 가능한 빨리 충전 염료를 수행하는 것이 좋습니다.
- 고정 무대 (그림 3)과 10X 공기 목적으로 똑바로 현미경 해부 비행과 Sylgard 접시를 놓습니다. 센터 염료 채우기 전극 홀더쪽으로 위치 파리의 사후 끝에있는 샘플. CVC에 차등 간섭 대비 (DIC) 모드와 포커스를 사용합니다. GFS의 큰 axons은 CVC의 등의 표면에 명확하게 표시해야합니다.
- 1 % 농도 deionized H2O에서 루시퍼 옐로우 CH dilithium 소금을 희석. 약 저항에 필라멘트와 Borosilicate 유리 전극을 당기세요. MΩ 60-80. 유리 전극의 끝이 길고 날카로운해야합니다. 약 루시퍼 노란 솔루션에 전극 팁 반대 끝에있는 전극을 배치을 1 % 루시퍼 노란색 솔루션으로 전극의 끝부분을 입력합니다. 30-60초. 다음 염색과 LiCl 사이의 기포를 떠나지 해밀턴 주사기를 사용하는 3M LiCl과 전극 backfill. 머리 단계에 염료 채우기 전극을 연결합니다.
- 식염에 염화 코팅 실버 와이어 접지 전극을 삽입하고 3D 유압 micromanipulator를 사용하여 VNC에 파리 병렬 위에 염료 채우기 전극을 배치. 염료 채우기 전극은 현재 각각을 통과 하이퍼 또는 depolarizing하여 전극에서 부정적 또는 긍정적으로 청구 염료 출시하기 위해 현재의 합격 수있는 앰프에 연결되어 있어야합니다.
- 40x 물 침지 렌즈로 전환하여 GFS 중 하나에 염료 작성 전극의 끝부분을 낮추십시오. GF의 axons은 CVC의 등의 표면에 가까이하다. GF에 전극을 삽입하기 위해 앞으로 (머리 방향) 운동을 사용합니다.
- epifluorescent 빛을 광원을 변경하고 루시퍼 옐로우 필터로 전환합니다. GF에 루시퍼 노란색을 삽입하기 위해 앰프와 염색 채워 전극에 hyperpolarizing 전류를 적용합니다. 색소 주입의 수량은 일에 의해 제어할 수 있습니다현재의 전자 금액은 전류가 전달되는 기간뿐만 아니라 전달. 사출 사이트 또는 손상 GF 밖으로 밝혀 지던에서 염료를 방지하기 위해, 그것은 1-5분 이상 낮은 전류 (약 3-5 NA)를 사용하여 주입하는 것이 좋습니다.
- VNC의 GF 터미널 (그림 4A) 분명하게 볼 수있을 때까지 현재 적용됩니다. postsynaptic 뉴런의 시냅스 횡단 얼룩 들어, 염료도 postsynaptic 뉴런에서 볼 수있을 때까지 현재의 전달로 진행합니다. 현재 끄고 염료 채우기 전극을 제거합니다.
3. 대표 결과 :
대표 염색 루시퍼 황색 한 GF에 대한 채우기 그림 4A에 표시됩니다. 이미지가 현미경에 장착된 현장 카메라를 사용하는 니콘 요소 소프트웨어에서 이미지를 스택으로 인수되었다. 이 예제에서는 현재 약 2 분 동안 전극 통과되었다. GF는 철저하게 채워되고 흉부에 큰 GF 단자가 잘 (그림 4A, 타원형) 표시됩니다. 루시퍼 노란색은 갑 분기점을 통과하는 정도로 작은 있지만 아무 postsynaptic 뉴런이 경우에는 표시되지 않습니다. 신호가 감지 너무 약한 때문에 염료가 GF에 충분히 주입하지 않은 경우 다음 횡단 시냅스 postsynaptic 뉴런의 채우고 볼되지 않을 수 있습니다. GFS (그림 4B, 화살표 머리)에 postsynaptic 뉴런은 같은 Neurobiotin과 같은 소규모의 연결을 추적하는을 사용하여보다 안정적으로 시각하실 수 있습니다. 이분에 대한 depolarizing 현재 2 M 칼륨 아세테이트 용액에 7 % Neurobiotin을 주입하는 것은 강하게 postsynaptic 뉴런 레이블을하기에 충분합니다. Neurobiotin 서로 다른 파장의 염료에 결합 Streptavidin를 사용 공촛점 현미경에 대한 시각하실 수 있습니다. Neurobiotin은 형광 염료가 아니므로, 같은 용액에 Rhodamin - Dextran 또는 알렉사 hydrazides의 공동 주사는 GF (그림 4C, Boerner 및 Godenschwege에서 2010 년 5)에 성공적으로 주사를 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다.
그림 1. 비행의 도식 그림은 옆으로 볼. 흉부는 내부 구조를 시각화하기 위해 세로 절개와 함께 표시됩니다. 해부 동안 지느러미 길이 비행 근육 (DLMs, 파란색)은 비행 근육으로 복부 자리 복부 신경 코드 (VNC, 딥 레드), 손상없이 절단되었습니다. 직감 (녹색)은 VNC 위에 자리잡고 있습니다.
그림 2. 해부 파리의 도설 볼 수 있습니다. 두 개의 핀이는 파리를 위치로 머리 뒤에 배치됩니다. 비행 근육 (DLM)를 통해 부착된 핀은 흉부가 열려시오. 내부 장기는 복부 신경 코드 (VNC)을 노출 제거되었습니다.
그림 3. 염료 작성 설정.
그림 4.) 루시퍼 노란색으로 가득 한 GF를 보여주는 VNC의 후부 부분의 Z - 투영. 이미지가 즉시 염료가 현장 카메라로 작성 후 인수되었다. 야생 형 동물에서 흉부에있는 터미널 (타원형)이 명확하게 볼 수 있습니다. B) GF 염료의 공촛점 이미지는 야생 타입 비행에 Neurobiotin로 기입하십시오. GFS (화살표)와 GFS (화살표 머리)에 postsynaptic 뉴런 모두 표시됩니다. Streptavidin은 Cy3로 결합과 Neurobiotin이 시각되었습니다. C) 야생 형 GFS의 공촛점 이미지 Alexa555 가득.
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Discussion
신경 계통은 플라이 본체에서 추출하지 않고 해부를하실 수 있습니다. 이 두 장점을 가지고 먼저, 해부 신경 시스템에 약간의 손상을 초래하고, 둘째, 대부분의 신경은 근육과 감각 기관에 붙어있어. 로 설명 절개를, 공연하는 것은 GFS의 정직 염료 라벨에 대한 샘플을 준비합니다. 편리, GFS에 postsynaptic motoneurons은 근육에 붙어있어. Axons 따라서, 더 이상 신경이 살아 유지 피해가 있습니다. 또한, 신경계 손상 갑 연결 기능을 중단 가능성이 있으므로 횡단 시냅스 채우고의 효능에 영향을 미칠 가능성이 높습니다.
루시퍼 노란색, Rhodamine dextran, 그리고 알렉사 플루어 히드라 지드 나트륨 소금 (Invitrogen)를 형광 현미경 GF의 형태의 즉각적인 시각화를 사용할 수 있지만 보조 형광 항체를 사용하여 증폭이 공촛점 현미경 5 고해상도 이미징을위한 권장 신호. 모두, 루시퍼의 황색뿐만 아니라 Neurobiotin 레이블로 횡단 시냅스를 통해 postsynaptic 세포가 Neurobiotin가 훨씬 더 신뢰할 수 있기 때문에 채워집니다. 그러나, Neurobiotin가 아닌 형광이며 성공적인 주사를 모니터하기 위해 다음과 immunohistochemistry 주입뿐만 아니라 두 번째 형광 염료의 공동 주사가 필요합니다.
이 기술은 정기적으로 동일한 유전자형의 개인 사이의 또는 다른 genotypes 5,6,7,8의 개인 간의 GF 단말기의 형태를 비교하는 데 사용되었습니다. 또한, 시냅스 단말기의 형태도 표준 절차 9,10에 의해 해부하기 전에 회로에서 electrophysiological 레코딩을 취득하여 기능을 상호하실 수 있습니다.
마지막으로, 우리 시연 절개 방법은 염료 주입과 GF 터미널, 염료 주입 후 머리 캡슐에서 두뇌의 후속 절개의 이미징을위한 VNC를 노출하지만 것은 GF 소마의 이미징 및 뇌뿐 dendrites를 허용 것입니다 .
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
설명이 프로젝트는 내용이 전적으로 저자의 책임이며 반드시 아동 보건 인간 발달이나 국립 연구소의 공식 견해를 대변하지 않는 태그를 아동 보건 인간 발달의 국립 연구소에서 부여 번호 R01HD050725 지원했습니다 보건 국립 연구소. 우리는 원고와 동영상을 자신의 입력을위한 Godenschwege 실험실뿐만 아니라 바바라 Schreader의 회원 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | ||
| Dissection Microscope | AmScope | SM-2TZ | |
| Vannas Scissors Superfine | Academic Instruments | VS1023 | |
| Dumont Forceps Dumontstar 55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1mm |
| Borosilicate Glass Electrodes | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 | |
| Vertical Pipette Puller 700c | David Kopf Instruments | Model 700C | |
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma-Aldrich | L0259 | 1% in H2O |
| Fixed Stage Upright Microscope & Camera | Nikon Instruments | FN-1 & DS-U2 Camera | |
| Plan Fluor 10X Air Objective | Nikon Instruments | CFI Plan Fluor 10X NA 0.3 WD 16mm | |
| Fluor 40X water dipping Objective | Nikon Instruments | CFI Fluor 40X W NA 0.80 WD 2.0mm | |
| 3D hydraulic Micromanipulator | Narishige International | Model MW0-3 | |
| Amplifier | Getting Instruments, Inc. | Model 5A |
References
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