Summary
このプロトコルは、ポリエチレングリコール沈殿によって、特に卵黄からの総IgYの抽出を説明し、IGY技術に関する一般的な情報を提供します。
Abstract
雌鶏は、IMワクチン接種（ 筋胸筋 、左と右、注入量0.5〜1.0ミリリットル）の手段によってまたは遺伝子銃プラスミド-予防接種による免疫することができる。抗原の免疫原性に依存し、高い抗体価は、（最大1:100,000 - 1:1,000,000）だけか3の後に達成することができます - 4ブースト予防接種を。通常は、鶏はその後産卵能力が低下し、約72週間連続して卵を産む。このプロトコルは、沈殿法の手段（PEG.ポルソンら 1980）で卵黄からの総IgYの抽出を説明します。方法は2つの重要なステップが含まれます。最初のものは、脂質の除去であり、2番目は第一段階の上清からの総IgYの降水量です。バッファ（通常はPBS）に対して透析した後IGY -エキスは一年以上は-20℃で保存することができます。抽出物の純度が80％程度であり、卵当たりの総IGYは、産卵鶏の年齢に依存し、40〜80 mgから変化する。最大80ミリグラム/卵（PEG沈殿に関する）に約40ミリグラム/卵から鶏の年齢と総IGYの含有量が増加する。年間鶏の産卵能力は325卵の周りです。 60mgの合計IGY /卵（表1参照）の平均IGYの内容に基づいて、20グラムの合計IGY /年間の総潜在的な収穫を意味する。
Protocol
1。プロトコル - IGY抽出PEG -沈殿による
図。 1 IGY -抽出手順の概略図を示します（表2参照）。プロトコルは、最初のポルソンらに記載されていた。 1980年。
すべてのステップは、ラテックスの手袋を使用して実行する必要があります。
- 卵殻は慎重に割れているし、卵黄はできるだけ白多くの卵として除去するために、"卵黄のスプーン"に転送されます。
- 卵黄をろ紙に移し、残りの卵白を削除するにはロールバックされ、その後、卵黄の皮膚は、ランセットまたは類似の楽器（ピペットチップ）で切断されています。卵黄は、50 mlチューブに注入し、卵の体積は、（V1）に登録されます。
- PBSで2回の卵黄量が総量の卵黄（ΣV1+ V2）、その後3.5％PEG 6000（グラムでは、微粉炭）と混合されているが追加され、ボルテックス、10分のローリングミキサーで圧延が続いている。抽出手順のそのステップは2段階で、懸濁液を分離します。一つの相は、"卵黄固体と脂肪性物質"（ポルソンらのオリジナルの引用。1980）とIGYと他の蛋白質を含む水の相から構成されています。
- チューブは4℃で遠心分離している℃で20分（10,000 rpmで13000 × gで、ヘレウスMultifuge 3SR +、固定アングルローターに応じて）のためのC。上清（V3）は、折り畳まれたフィルターを通して注ぎ、新しいチューブに移している。
- グラム（新しいボリュームに応じて計算）で8.5％PEG 6000は、チューブに加え、ボルテックスし、手順3のようにローリングミキサーにロールバックされます。
- 上清を廃棄していることの違いと手順4を繰り返します。
- ペレットは、慎重にガラス棒とボルテックスを用いて1mlのPBSに溶解させる。 PBSを10mlの最終容量（V4）に追加されます。溶液を12％のPEG 6000（w / vの、1.2グラム）と混合し、ステップ3（ボルテックス、ローリングミキサー）と同様に扱われます。
- 手順6を繰り返しますし、800μlのPBS（ガラス棒とボルテックス）で慎重にペレットを溶解する。消えるのに空気泡を待って、透析のカプセルへの転送（ピペット）エキス。 400μlのPBSでチューブをリンスし、透析装置（V5）にボリュームを追加します。 （透析装置や膜の調製については付録を参照してください。）
- 抽出物を0.1％生理食塩水で一晩透析し（1,600 ml）をゆっくりとマグネチックスターラーにより撹拌する。翌朝は、生理食塩水をPBSで置き換え別の3時間透析されています。
- その後IGY -エキスをピペットで透析のカプセルから取り出され、2ミリリットルチューブに転送されます。最終容量は2ml（V6）程度である。
- サンプルのタンパク質含有量（mg / mL）を280 nmの（PBSで希釈1:50）で光学的に測定し、IGYのための1.33の吸光係数とランベルトベールの法則（図2参照）、図に基づいて計算されます。 。 4は、準備の品質（純度と回収率は約80％である）を示しています。
- それは、° C（-70 ° Cでサンプルを凍結していない）-20アリコートでサンプルを保存することをお勧めします。
- Joveのプロトコルで説明されているように最終的な準備の質は、単純なSDS - PAGEによって分析されるhttp:/www.jove.com/details.php?id=1916
2。透析バッグを使用する前に、付録は、製造業者の推奨に従って、次の方法で準備する必要があります。
- 20透析バッグは、30cmの片に切断し、2000mlのガラスビーカーに記載されています。
- 5mMのEDTA -ソリューションの1750ミリリットルが追加されます。
- ガラス漏斗は、袋をEDTA溶液でカバーされることを保証するために袋の上に配置されます。溶液を5分間（ホットプレート）加熱し、沸騰させる。ソリューションをデカントし、バッグを蒸留水で3回洗浄する。
- 再び1750ミリリットルEDTA -溶液を加え、5分間煮沸し、上記のように蒸留水で3回洗浄する。
- 最終的に透析バッグを蒸留水で10分間煮沸し、4℃で保存されています滅菌ピンセットを用いて透析バッグを取り出してください。
3。代表的な結果
図1。ポルソンらのオリジナルの記述に従ってポリエチレングリコール沈殿法によるIGY抽出の模式図。 1980年。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図2年齢依存性で免疫鶏の卵黄の合計- IgYの開発。合計IGY /卵とSD（n = 4の産卵鶏）の週平均がされ与えられた。 [ポーリーら 2009]から）。
図3。拉乙別の抗原で免疫four鶏のngの容量の監視。矢印は、予防接種の日付を（[ポーリーら 2009]から）を示している。 こちらをクリックして拡大画像を表示するには。
還元条件下での異なる卵から個々のIGYの準備の図4。ポリアクリルアミド- Gelelectrophoresis
レーン1 - 分子量マーカー、レーン2 - IGY - 標準、レーン3-5 - プロトコルに記載したように調製した異なるIGYサンプル。これらはプロトコルの手順10によれば、最終的な製剤である。 HC - 重鎖、LC - 光chaines、？ - 35 kDaの（おそらくビテロゲニンIIの前駆体のC末端フラグメント、[。Klimentzou ら 、2006]）程度の分子量に対応するマイナー不純物。
| チキン21（抗原A） | チキン22（抗原A） | チキン19（抗原B） | チキン23（抗原C） | |
| 卵の数（合計IGY）1、2年間の期間 | 625（38グラム） | 626（38グラム） | 545（33グラム） | 608（37グラム） |
| 卵の数（合計IGY）、初年度 | 345（20g）を | 304（16グラム） | 326（18グラム） | 308（17グラム） |
| 卵の数（合計IGY）、二年目 | 280（18グラム） | 322（21グラム） | 219（15グラム） | 300（20g）を |
| maxの％。可能な卵の数（初年度）2 | 106 | 93 | 100 | 95 |
| maxの％。可能な卵の数（2年） | 86 | 99 | 67 | 92 |
| 処理された卵の数 | 565 | 620 | 283 | 401 |
総IgYの1量は、図2のデータによると卵あたり60 mgのタンパク質の平均値によって卵の数を乗じて計算されます。
2以下 。年間可能な卵の数は、ブリーダーの情報によると325です。
表1。異なる抗原で免疫された鶏の産卵能力の2年間の統計。 （図も参照してください。3）二年の間に異なる抗原だけでなく、IGY -成果による免疫後4鶏の最大のパーセントで容量を敷設、[ポーリーら 2009]）。
| 卵番号nr。 | ヘン数Nr。日付を敷設 | V1 [ML]卵黄 | V2 [ML] PBS | 1。 PEG PREC。 [G] | VOL [ML]の後に | 2。 PEG PREC。 [G] | ペレット | 3。 PEG PREC。 [G] | ペレット | VOL [ML] | 総タンパクmg / mlの | 補正した総タンパクmg / mlの |
| 2xV1ΣV1+ V2 | 3,5％[w / vの]ΣV1+ V2 | precは。、centrif。とろ過のV3 | 8,5％[w / vの] V3 | V4 mlのPBSに溶解 | 12パーセント[W / V] V4 | mlのPBS V5に溶解 | PBS V6に対して透析後、 | A280/ml | A280/ml：1.33 | |||
| 1 | H293 / 22.10。 | 15 | 30 45 | 1.58 | 31 | 2.63 | 10 | 1.2 | 1.2 | 1.7 | 35.0 | 26.3 |
| 2 | H293 / 23.10。 | 13 | 26 39 | 1.37 | 25 | 2.12 | 10 | 1.2 | 1.2 | 1.7 | 28.8 | 21.6 |
表2。PEG沈殿の典型的なプロトコル
Discussion
適切なIGYの精製法の選択は、精製のスケール（実験室または工業用）、費用対効果、技術（実験装置）、および環境への影響（廃棄物管理）の影響を受けています。様々なIGY抽出法は、デMeulenaer＆Huyghebaert（2001年、レビューのためにも、シャーデらを参照してください。2005）によって詳細に検討された。一般的に、これらの方法は3つの主要なグループに分けることができます。
- 降水方法：アンモニウムまたは硫酸ナトリウム、ポリエチレングリコール（PEG）、カプリル酸とcaragenean含む。
- クロマトグラフィー法：アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、thiophylic相互作用クロマトグラフィー、およびゲルろ過クロマトグラフィー。
- 限外ろ過 。
IGY準備の純度は方法の組み合わせによって増加することができます、例えば、PEG沈殿、アフィニティークロマトグラフィーと組み合わせることができます。いくつかの例では、最終的なアプリケーションに応じて、IgYの水抽出物は、良好な結果を（秋田＆中井1993）を達成するのに十分です。我々の経験によると、我々はPEG -沈殿により得るIGY -サンプルは、異なる免疫学的アッセイの多くで非常にうまくいった。 PEG -沈殿法を標準化することによって、一つの技術アシスタントは4と7 g当たり週の間に合計IgYの量に相当する週当たり約84卵を、処理することができます。簡単な計算：産卵鶏は、抗原で免疫される。いくつかのブースト予防接種後篇は30日の期間中1:50,000の力価と特異的抗体（AB）を生成します。 30卵X 2ミリリットルIGYエキスは、（プロトコルおよび図3を参照）3000リットルを意味する順番に3000リットルのAB -希釈（バケットの容量が10リットル）に相当する60ミリリットル合計IGY、、に対応抗体の溶液300mlバケットが満たされることができる。そう、このような巨大なAB -量のビューでは、一定の質と特異性の抗体プールを格納するためには問題ありません。この手法は、特に多特異性抗体で観察される電荷/ロットばらつきを低減します。
哺乳類の補体系のない活性化、HAMA（ヒト抗マウス抗体）、リウマチ因子やヒトの血液型抗原（heteroagglutininsの欠如）との交差反応性：量の側面にもかかわらず、IGY抗体は、哺乳動物のIgGと比較して、さらに利点があります。
IGY - ABの優れた利点は、いわゆる系統発生の距離です。系統学的距離は、同じ免疫場合でも、哺乳類とニワトリの抗体の特異性の間で頻繁に説明している違いがある理由です。哺乳類と鳥類の免疫系自体の違いに加えて、これら2つの動物クラスの系統発達の違いは、異なる抗体の特異性に寄与する。いくつかの著者は、鶏がしばしばより効率的にウサギが（審査のシャーデらA. 2005を参照）よりも系統発生的に高度に保存された哺乳類タンパク質またはペプチドに対してAbsを生成することが報告されている。結果として、保存された抗原はウサギ免疫システムに"マスク"のまま、そのためだけ弱いまたは"サイレント"応答を引き起こす可能性があります。さらに、非常に頻繁に、鶏やウサギが同じ哺乳類の抗原で免疫されている場合、鶏はほとんどウサギで達成することができるAB -特異性と反応する。抗体は、非侵襲的に卵黄から抽出されるので、また、動物福祉の側面が重要です。組み合わせで遺伝子銃（プラスミド）予防接種でIGY -生産（ウィトコフスキーら 2009）完全に非侵襲的です。
結論では、PEG -沈殿による鶏とIGY抽出における抗体の生産は非常に費用対効果が高く、最大100万分の1まで安定して力価を持つ非常に特異的な抗体の結果です。 鳥類と哺乳類との間の系統発生の距離が原因で、鶏肉は、例えばウサギとは対照的に高度に保存された哺乳類の抗原に対する特異的抗体を生成することができる。 IGY -技術によって得られた抗体の異常な量は、治療的/予防目的のために人間や動物用医薬品でIGY - Abを使用するためにも扉を開きます。
Disclosures
動物実験はLandesamt毛皮お大事にウントSozialesベルリン（H 0069/03）によって定められたガイドラインおよび規制に準拠して行った。
Acknowledgments
この作品は、教育研究のドイツ連邦環境省（プロジェクトBiGRUDI [：R isikobewertung、U ltraschnelle D etektionウント私 dentifizierungフォンbioterroristisch relevanten Agenzien、13N9594のBi ologische G efahrenlagen]）からの助成金によって支えられて。我々は優秀な技術支援のためにB. Diemar（シャリテ- Universitätsmedizinベルリン、研究所こだわりPharmakologieを）感謝。
Materials
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References
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