Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

IGY التكنولوجيا : استخراج الأجسام المضادة من صفار البيض الدجاج بواسطة البولي ايثيلين جلايكول (PEG) الأمطار

doi: 10.3791/3084 Published: May 1, 2011

Summary

يصف هذا البروتوكول في مجال استخراج وبخاصة من مجموع IGY من صفار البيض عن طريق الترسيب البولي ايثيلين جلايكول ، ويعطي معلومات عامة حول التكنولوجيا IGY.

Abstract

يمكن تحصين الدجاج عن طريق التلقيح ايم (العضلة الصدرية ، اليسار واليمين ، وحجم الحقن 0،5-1،0 مل) أو عن طريق التحصين البلازميد الجينات بندقية. تعتمد على استمناع للمستضد ، وارتفاع عيارات الأضداد (إلى 1:100،000 -- 1:1،000،000) لا يمكن أن يتحقق إلا بعد واحد أو 3 -- تعزيز التحصينات 4. عادة ، دجاجة تبيض باستمرار لحوالي 72 أسابيع ، بعد ذلك يقلل القدرة على زرع. يصف هذا البروتوكول استخراج IGY من مجموع صفار البيض عن طريق إجراء هطول الأمطار (PEG. Polson آخرون 1980). الأسلوب ينطوي على خطوتين مهمتين. أول واحد هو إزالة الدهون ، والثاني هو ترسب IGY الكامل من طاف من خطوة واحدة. ويمكن بعد غسيل الكلى ضد العازلة (PBS عادة) يتم تخزين IGY ، في استخراج -20 درجة مئوية لمدة أكثر من عام. نقاء من استخراج ما يقارب 80 ٪ ، ومجموع IGY في البيض يختلف 40-80 ملغ ، تعتمد على عمر الدجاجة زرع. محتوى IGY مجموع الزيادات مع عمر الدجاجة من حوالي 40 ملغ / البيض يصل إلى 80 مغ / البيض (PEG بشأن الأمطار). القدرة زرع دجاجة سنويا حوالي 325 بيضة. هذا يعني الحصاد الكلي المحتمل للIGY 20 غ من الكل / السنة على أساس المحتوى IGY يعني من 60 ملغ مجموع البيض IGY / (أنظر الجدول 1).

Protocol

1. بروتوكول -- IGY الاستخراج عن طريق الربط بين هطول الأمطار

التين. 1 يعطي الرسم التخطيطي للإجراءات استخراج IGY (انظر الجدول 2). وكان أول وصف للبروتوكول في Polson وآخرون. 1980.
يجب أن يتم تنفيذ جميع الخطوات باستخدام قفازات مطاطية.

  1. مشققة بعناية قشر البيض وصفار نقل الى "ملعقة صفار" من أجل إزالة الكثير من البيض والبيض ممكن.
  2. ينقل إلى ورقة صفار تصفية وتدحرجت لإزالة ما تبقى البيض ، ثم يتم قطع الجلد مع صفار مبضع أو صك مماثل (ماصة الحافة). يتم صب صفار في أنبوب 50 مل ويتم تسجيل حجم البيضة (V1).
  3. يضاف مرتين يختلط حجم صفار البيض من برنامج تلفزيوني مع (ΣV1 + V2) الصفار ، 6000 بعد ذلك PEG 3.5 ٪ (في غرام ، المسحوق) من حجم التداول الكلي وvortexed ، تليها 10 دقيقة يلف على خلاط المتداول. ان خطوة من هذا الإجراء استخراج يفصل التعليق على مرحلتين. مرحلة واحدة تتكون من "المواد الصلبة والمواد الدهنية صفار" (الاقتباس الأصلي Polson وآخرون 1980) والتي تحتوي على بروتينات المرحلة مائي IGY وغيرها.
  4. وطرد الأنابيب عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة (10،000 دورة في الدقيقة وفقا ل13000 XG ، هيراوس Multifuge 3SR + ، الدوار الزاوية الثابتة). يسكب طاف (V3) من خلال مرشح مطوية ونقل إلى أنبوب جديد.
  5. تضاف 8.5 ٪ PEG 6000 في غرام (محسوبة وفقا لحجم جديد) إلى أنبوب ، وتدحرجت على vortexed خالط المتداول كما في الخطوة 3.
  6. كرر الخطوة 4 مع فارق أن يتم تجاهل طاف.
  7. يذوب بعناية بيليه في برنامج تلفزيوني 1 مل عن طريق العصا والزجاج وvortexer. إضافة إلى برنامج تلفزيوني الحجم النهائي من 10 مل (V4). خلط حل مع 6000 PEG 12 ٪ (W / V ، 1.2 غرام) ويعامل كما في الخطوة 3 (الدوامة ، خلاط المتداول).
  8. كرر الخطوة 6 و حل بيليه بعناية في 800 برنامج تلفزيوني ميكرولتر (زجاج العصا والدوامة). انتظر أن تختفي فقاعات الهواء ومن ثم نقل (ماصة) لاستخراج الكبسولات لغسيل الكلى. شطف الأنبوب مع 400 برنامج تلفزيوني ميكرولتر وإضافة الصوت إلى جهاز غسيل الكلى (V5). (للحصول على إعداد أجهزة غسيل الكلى والأغشية انظر الملحق).
  9. هو dialysed استخراج المياه المالحة في أكثر من ليلة 0.1 ٪ (1600 مل) ، وأثار بلطف عن طريق مغناطيسي. في صباح اليوم التالي ، يتم استبدال المالحة بواسطة برنامج تلفزيوني وdialysed لمدة ثلاث ساعات.
  10. بعد ذلك يتم سحبها IGY ، مستخرج من الكبسولة غسيل الكلى بواسطة ماصة ونقل إلى أنابيب 2ml. الحجم النهائي هو حوالي 2 مل (V6).
  11. يتم قياس نسبة البروتين (ملغ / مل) من عينات photometrically في 280 نانومتر (1:50 المخفف مع PBS) وتحسب وفقا للقانون لامبرت مع معامل البيرة انقراض 1.33 لIGY (انظر الشكل رقم 2) ، والشكل . 4 يبين نوعية التحضير (النقاء والانتعاش حوالي 80 ٪).
  12. فمن المستحسن لتخزين العينات في aliquots في -20 درجة مئوية (لا تجميد العينات في -70 درجة مئوية).
  13. ويتم تحليل نوعية التحضيرات النهائية بسيطة SDS - PAGE كما هو موضح في البروتوكول إن الرب http:/www.jove.com/details.php؟id=1916

2. التذييل ، قبل استخدامه يجب أن يكون مستعدا لحقيبة غسيل الكلى بالطريقة التالية وفقا لتوصيات الشركة المصنعة :

  1. يتم قطع أكياس الغسيل الكلوي في 20 قطعة من 30 سم وبالنظر في الدورق الزجاجي 2000 مل.
  2. يتم إضافة 1750 مل من EDTA - 5 مم الحل.
  3. يتم وضع قمع زجاجي فوق الحقائب لضمان تغطية أكياس من حل EDTA. يتم تسخين المحلول والمغلي لمدة 5 دقائق (لوحة الساخنة). ويصب في الحل ، ويتم غسل أكياس ثلاث مرات بالماء المقطر.
  4. مرة أخرى يتم إضافة 1750 مل EDTA محلول مغلي لمدة 5 دقائق ويغسل ثلاث مرات بالماء المقطر على النحو الوارد أعلاه.
  5. وأخيرا مغلي أكياس الغسيل لمدة 10 دقيقة في ماء مقطر وتخزينها في 4 درجات مئوية. إخراج أكياس الغسيل الكلوي بواسطة ملاقط معقمة.

3. ممثل النتائج

الشكل 1
الشكل 1. رسم تخطيطي لاستخراج - IGY عن طريق الترسيب البولي ايثيلين جلايكول وفقا لتوصيف الأصلي Polson وآخرون. 1980. لعرض صورة أكبر حجما انقر هنا.

الشكل 2
الشكل 2. تنمية IGY المجموع في صفار البيض والدجاج في الاعتماد تحصينهم من العمر. معين هو يعني الأسبوعية من مجموع البيض / IGY و SD (ن = 4 الدجاج البياض). من [وآخرون بولي. 2009]).

الشكل 3
الشكل 3. Layiنانوغرام رصد قدرة أربع دجاجات تحصين مع مستضدات مختلفة. الأسهم تشير إلى تاريخ التحصين (من [وآخرون بولي. 2009]). انقر لعرض صورة أكبر هنا.

الشكل 4
الشكل 4. بولي أكريلاميد - Gelelectrophoresis الاستعدادات IGY الفرد من البيض تحت مختلف الظروف الحد
أعدت عينات IGY مختلفة كما هو موضح في البروتوكول -- حارة 1 -- الوزن الجزيئي علامة ، لين 2 -- IGY قياسي ، لين 3-5. هذه هي التحضيرات النهائية وفقا للخطوة 10 من البروتوكول. HC -- السلاسل الثقيلة ، LC -- chaines الخفيفة ،؟ -- الشوائب البسيطة الموافق الوزن الجزيئي حوالي 35 كيلو دالتون (وربما جزء من محطة C - II vitellogenin السلائف ، [Klimentzou وآخرون ، 2006.]).

  الدجاج 21 (أ مستضد) الدجاج 22 (A مستضد) الدجاج 19 (B المستضد) الدجاج 23 (C مستضد)
عدد البيض (IGY الكل) 1 و 2 سنوات الفترة 625 (38 ز) 626 (38 ز) 545 (33 ز) 608 (37 ز)
عدد البيض (IGY الإجمالي) ، السنة الأولى 345 (20 ز) 304 (16 ز) 326 (18 ز) 308 (17 ز)
عدد البيض (IGY الإجمالي) ، السنة الثانية 280 (18 ز) 322 (21 ز) 219 (15 ز) 300 (20 ز)
٪ من الحد الأقصى. عدد ممكن البيض (السنة الأولى) 2 106 93 100 95
٪ من الحد الأقصى. عدد ممكن البيض (السنة الثانية) 86 99 67 92
عدد البيض المصنعة 565 620 283 401

ويتم احتساب مبلغ 1 IGY مجموع بضرب عدد من البيض بنسبة قيمة يعني ملغ من البروتين بنسبة 60 في البيض وفقا لبيانات الشكل 2.

(2) كحد أقصى. عدد ممكن بيضة سنويا هو 325 وفقا لمعلومات من مربي.

الجدول 1. عامين إحصاءات القدرة البيض من الدجاج مع تحصين مستضدات مختلفة. وضع القدرات في المئة من الحد الأقصى لأربع دجاجات بعد التحصين مع مستضدات مختلفة فضلا عن IGY نتائج خلال سنتين (انظر أيضا الشكل 3) ، [بولي آخرون 2009]).

البيض العدد. الدجاجة العدد. وضع تاريخ V1 [مل] صفار V2 [مل] PBS 1. PEG PREC. [ز] المجلد [مل] بعد 2. PEG PREC. [ز] كرية 3. PEG PREC. [ز] كرية المجلد [مل] مجموع ملغ من البروتين / مل إجمالي البروتين تصحيح ملغ / مل
2xV1 ΣV1 V2 + 3،5 ٪ [ث / V] ΣV1 V2 + PREC. ، centrif. والترشيح V3 8،5 ٪ [ث / V] V3 الذائب في برنامج تلفزيوني مل V4 12 ٪ [ث / V] V4 الذائب في برنامج تلفزيوني مل V5 بعد غسيل الكلى ضد V6 PBS A280/ml A280/ml : 1.33
1 H293 / 22،10. 15 30 45 1.58 31 2.63 10 1.2 1.2 1.7 35.0 26.3
2 H293 / 23،10. 13 26 39 1.37 25 2.12 10 1.2 1.2 1.7 28.8 21.6

الجدول 2. البروتوكول المثالي لهطول الأمطار PEG

Discussion

ويتأثر اختيار الطريقة المناسبة التي IGY تنقية نطاق تنقية (المختبرية أو الصناعية) ، وفعالية التكاليف ، والتكنولوجيا (معدات المختبرات) ، وتأثيرها على البيئة (إدارة النفايات). وتم استعراض مختلف أساليب الاستخراج IGY بالتفصيل Meulenaer دي & هيوغيبارت (2001 ، للمراجعة وانظر أيضا شايد وآخرون 2005). بصفة عامة ، يمكن تقسيم هذه الطرق إلى ثلاث مجموعات رئيسية هي :

  1. أساليب الأمطار : تشمل الأمونيوم كبريتات الصوديوم أو ، polyethyleneglycol (PEG) ، وحمض الكابريليك وcaragenean.
  2. الكروماتوغرافي : طرق التقارب اللوني ، ايون اللوني الصرف ، مسعور اللوني التفاعل اللوني thiophylic التفاعل ، وهلام اللوني الترشيح.
  3. الفائق.

ويمكن زيادة نقاء استعدادا IGY عن طريق مزيج من الأساليب ، على سبيل المثال ، يمكن الجمع بين الربط مع هطول الأمطار اللوني تقارب. في بعض الحالات ، اعتمادا على التطبيق النهائي ، واستخراج المياه من IGY غير كافية لتحقيق نتائج جيدة (اكيتا وناكاي 1993). ووفقا لخبرتنا ، عملت IGY عينة نحصل بواسطة الربط بين هطول الأمطار بشكل جيد جدا في الكثير من المقايسات المناعية المختلفة. عن طريق توحيد أسلوب الربط بين هطول الأمطار ومساعد تقني قادر على معالجة ما يقرب من 84 بيضة في الأسبوع ، وهو ما يعادل مبلغ IGY الإجمالي بين 4 و 7 غ في الأسبوع. عملية حسابية بسيطة : هو تحصين وضع الدجاجة مع المستضد. بعد زيادة التحصينات القليلة الدجاجة تنتج الأجسام المضادة المحددة (آب) مع من عيار 1:50،000 خلال فترة 30 يوما. 30 بيضة × 2 مل IGY استخراج (انظر البروتوكول والشكل 3) يناظر مجموع IGY 60 مل ، والذي بدوره يتوافق مع AB - تمييع 3000 لتر (قدرة دلو هو 10 لتر) ، وهذا يعني مع 3000 لتر يمكن حل آب تملأ 300 الدلاء. بذلك ، في ضوء مثل هذه الكمية الضخمة ، أب أنه لا توجد مشكلة لتخزين AB - تجمع ثابت من الجودة والنوعية. هذا الأسلوب يقلل من التباين تهمة / الكثير لاحظ ذلك في آب polyspecific.

على الرغم من الجانب الكمي ، IGY أب لها مزايا إضافية بالمقارنة مع مفتش الثدييات : لا تكمل تفعيل نظام الثدييات ، وليس عبر التفاعل مع حماة (الأجسام المضادة البشرية المضادة الماوس) ، والعوامل البشرية المفاصل أو مستضدات فئة الدم (نقص heteroagglutinins).

ميزة المعلقة IGY ، أب هي المسافة النشوء والتطور ما يسمى. المسافة النشوء والتطور هو السبب وراء الاختلافات ووصف كثير من الأحيان بين الخصوصيات آب من الثدييات والطيور ، حتى عندما تحصين مماثل. بالإضافة إلى الاختلافات بين الثدييات والطيور النظام المناعي أنفسهم ، والاختلافات في التنمية النشوء والتطور في هذه الفئات الحيوانية two يساهم في آب خصوصيات مختلفة. وذكرت العديد من الكتاب أن الدجاج غالبا ما تنتج عبس ضد بروتينات عالية phylogenetically الثدييات الحفظ أو الببتيدات أكثر كفاءة من القيام الأرانب (انظر شايد للمراجعة وآخرون (أ) 2005). ونتيجة لذلك ، يمكن للمستضد الحفظ تظل "ملثمون" للنظام المناعي الأرنب ، وتتسبب بالتالي سوى ضعف أو "صامتة" الاستجابة. وعلاوة على ذلك ، إذا تم تلقيح الدجاج والأرانب والثدييات مع المستضد نفسه ، كثيرا ما تستجيب الدجاج مع خصوصية - آب نادرا ما يمكن أن يتحقق في الأرانب. أيضا جانب من جوانب رفاه الحيوان مهمة منذ آب جراحية غير قابلة للاستخراج من صفار البيض. بالاشتراك مع التحصين (البلازميد) الجينات بندقية IGY الإنتاج تماما غير الغازية (Witkowski آخرون 2009).

في الختام ، وإنتاج الدجاج في آب وIGY الاستخراج عن طريق الربط بين التساقط جدا فعالة من حيث التكلفة والنتائج في آب محددة للغاية مع عيارات مستقرة تصل إلى 1:1،000،000. نظرا لبعد المسافة بين النشوء والتطور وأفيس Mammalia والدجاج هي قادرة على انتاج آب محددة ضد مستضدات الثدييات حفظا للغاية على عكس الأرانب على سبيل المثال. وكمية غير عادية من أب حصلت عليها IGY التكنولوجيا يفتح الباب أيضا لاستخدام IGY ، بكالوريوس في الطب البشري والطب البيطري لأغراض علاجية / وقائية.

Disclosures

وقد أجريت تجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها الفراء Landesamt Gesundheit برلين Soziales اوند (0069/03 ه).

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من خلال منحة من الوزارة الاتحادية الألمانية للتعليم والبحوث (المشروع BiGRUDI [بي جي ologische efahrenlagen : R isikobewertung ، ش ltraschnelle D etektion اوند أنا dentifizierung فون bioterroristisch relevanten Agenzien ، 13N9594]). نشكر باء Diemar (شاريتيه - Universitätsmedizin برلين ، ومعهد FÜR Pharmakologie) للحصول على مساعدة فنية ممتازة.

Materials

  1. Dialyse Bag Visking, Type 27/32, cut off -14 kD, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany
  2. Falcon tubes Blue Max, 50 ml Polypropylene Conical Tube, Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes NY, USA
  3. Folded Filter MN 615 ¼, 150 mm, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany Heraeus
  4. Magnetic stirrer, Variomag Mono, H+P Labortechnik AG, Oberschleißheim, Germany
  5. Micro-Dialyse-Capsule 5,0 ml, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany
  6. Multifuge 3SR+, Thermo Scientific, Langenselbold, Germany
  7. Photometer UV-160A, Shimadzu Deutschland GmbH, Duisburg, Germany
  8. Polyethylene Glycol 6000, Rotipuran Ph. Eur., Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany
  9. Premixed PBS-Buffer 10x, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany
  10. Roller Mixer SRT2, Stuart, Staffordshire, UK
  11. Vibrofix VF2, Janke & Kunkel, IKA-Labortechnik, Staufen i.Br., Germany
  12. Yolk spoon, Fackelmann (houshold effects), Germany

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Akita, E. M., Nakai, S. Comparison of four purification methods for the production of immunoglobulins from eggs laid by hens immunized with an enterotoxigenic E. coli strain. J. Immunol. Methods. 160, 207-214 (1993).
  2. De Meulenaer, B., Huyghebaert, A. Isolation and purification of chicken egg yolk immunoglobulins: a review. Food Agricult. Immunol. 13, 275-288 (2001).
  3. Klimentzou, P., Paravatou-Petsotas, M., Zikos, C. h, Beck, A., Skopeliti, M., Czarnecki, J., Tsitsilonis, O., Voelter, W., Livaniou, E., Evangelatos, G. P. Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly, immunogenic polypeptide prothymosin alpha. Peptides. 27, 183-193 (2006).
  4. Pauly, D., Dorner, M., Zhang, X., Hlinak, A., Dorner, B., Schade, R. Monitoring of laying capacity, immunoglobulin Y concentration, and antibody titer development in chickens immunized with ricin and botulinum toxins over a two-year period. Poultry Science. 88, 281-290 (2009).
  5. Polson, A., von Wechmar, M. B., van Regenmortel, M. H. Isolation of viral IgY antibodies from yolks of immunized hens. Immunol. Commun. 9, 475-493 (1980).
  6. Schade, R., Behn, I., Erhard, M., Hlinak, A., Staak, C. Chicken egg yolk antibodies, production and application : IgY-Technology. Springer. Berlin. (2001).
  7. Schade, R., Calzado, E. G., Sarmiento, R., Chacana, P. A., Porankiewicz-Asplund, J., Terzolo, H. R. Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): a review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine. Altern. Lab Anim. 33, 129-154 (2005).
  8. Witkowski, P. T., Bourquain, D. R., Hohn, O., Schade, R., Nitsche, A. Gene gun-supported DNA immunisation of chicken for straightforward production of poxvirus-specifiv IgY antibodies. J. Immunol. Methods. 341, 146-153 (2009).
IGY التكنولوجيا : استخراج الأجسام المضادة من صفار البيض الدجاج بواسطة البولي ايثيلين جلايكول (PEG) الأمطار
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pauly, D., Chacana, P. A., Calzado, E. G., Brembs, B., Schade, R. IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol (PEG) Precipitation. J. Vis. Exp. (51), e3084, doi:10.3791/3084 (2011).More

Pauly, D., Chacana, P. A., Calzado, E. G., Brembs, B., Schade, R. IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol (PEG) Precipitation. J. Vis. Exp. (51), e3084, doi:10.3791/3084 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter