En<em> In vitro</em> Model for cerebral malaria beslaglæggelse, er beskrevet<sup> 1</sup>.<em> Plasmodium falciparum</em> Inficerede røde blodlegemer er udvalgt for binding til foreviget menneskelige hjerne mikrovaskulære endotelceller. De valgte parasitter viser en tydelig fænotype. Udvælgelsesprocessen kan anvendes ved hjælp af forskellige<em> P. falciparum</em> Stammer og endotelceller linjer.
De fleste mennesker malaria dødsfald er forårsaget af blod-trins Plasmodium falciparum parasitter. Cerebral malaria, den mest livstruende komplikation af sygdommen, er karakteriseret ved en ophobning af Plasmodium falciparum inficerede røde blodlegemer (iRBC) på pigmenteret trophozoite stadium i microvasculature af hjernen 2-4. Denne microvessel obstruktion (optag) fører til acidose, hypoxi og skadelige inflammatoriske cytokiner (revideret i 5). Binding findes også i de fleste mikrovaskulære væv af det menneskelige legeme 2, 3. Den mekanisme, hvormed iRBC tillægger blodkarrenes vægge er stadig dårligt forstået.
Den udødeliggjort Human Brain mikrovaskulære endotelceller linje (HBEC-5i) har været anvendt som en in vitro model af blod-hjerne barrieren 6. Men Plasmodium falciparum iRBC vedhæfte kun dårligt på HBEC-5i in vitro, i modsætning til den tætte sequestration, der forekommer i cerebral malaria tilfælde. Vi har derfor udviklet en panorering assay for at vælge (berige) diverse P. falciparum stammer til vedhæftning på HBEC-5i for at få populationer af høj-bindende parasitter, mere repræsentative for, hvad der sker in vivo.
En prøve af en parasit kultur (blanding af iRBC og ikke-inficerede RBC) på pigmenteret trophozoite scenen er vasket og inkuberes på et lag af HBEC-5i dyrket på en petriskål. Efter inkubation, er fadet vaskes forsigtigt fri for uRBC og ubundet iRBC. Frisk uRBC føjes til de få iRBC knyttet til HBEC-5i og inkuberes natten over. Som schizont fase parasitter brast, merozoites reinvade RBC, og disse ring fase parasitter er høstet den følgende dag. Parasitter dyrkes, indtil nok materiale er opnået (typisk 2 til 4 uger), og en ny runde af valg kan udføres. Afhængig af P. falciparum stamme, fra 4 til 7 runder til udvælgelse er nødvendige for at få en befolkninghvor de fleste parasitter binder sig til HBEC-5i. Bindingen fænotypen er gradvist mistet efter et par uger, hvilket indikerer et skifte i variant overfladeantigen genekspression og dermed regelmæssig udvælgelse på HBEC-5i er forpligtet til at opretholde fænotype.
Sammenfattende har vi udviklet et udvalg assay rendering s. falciparum parasitter en mere "cerebral malaria lim" fænotype. Vi var i stand til at vælge 3 ud af 4 s. falciparum pres på HBEC-5i. Denne analyse har også med succes blevet brugt til at vælge parasitter for binding til humane dermal og pulmonal endotelceller. Vigtigt er det, kan denne metode bruges til at vælge vævsspecifikke parasit populationer for at identificere kandidat parasit ligander for binding til hjernens endotel. Desuden kan denne analyse bruges til at screene for formodede anti-beslaglæggelse medicin 7.
Kendetegnet for cerebral malaria er binding af P. falciparum iRBC i hjernen microvasculature 2, 3. Men in vitro kulturer af P. falciparum kun dårligt cytoadhere til HBEC-5i, en model for den menneskelige hjerne microvascular endothelium. Her har vi udviklet en enkel assay at berige en befolkning for binding til HBEC-5i, en mere "in vivo-lignende" fænotype. Tre ud af 4 s. falciparum stammer blev med succes valgt at bruge denne metode. Endvidere blev HB3 også valgt på HDMEC og HPMEC, hvilket indikerer, at denne protokol kan bruges til forskellige parasit og endotelceller typer.
Forskellige hypoteser kan forklare den manglende bindende med DD2 stamme. Det mest sandsynlige er, at denne parasit linje er knobless, som dybt hindrer cytoadherence 13, 14.
Vi anbefaler dyrkning fravalgt parasitter sammen med udvælgelsen Proces at give en kontrol for sammenligning. Dette vil gøre det muligt for eksempel at sammenligne transkriptom af bindende og ikke-bindende parasitter, med håbet om at opdage parasitten ligand kandidater.
TNF er et cytokin findes på højt niveau i cerebral malaria patienter og har vist at inducere udtryk for mange overfladeproteiner af HBEC-5i (Claessens et al, i forberedelse og 8, 15, 16). I dette tilfælde, var mængden af bundet iRBC lignende i normale HBEC-5i forhold til aktiverede HBEC-5i.
Denne "binding-modellen" kan også bruges til at studere de molekylære samspil mellem iRBC og endotelceller samt effekten af formodede anti-cytoadherence narkotika. I dette tilfælde anbefaler vi plating HBEC-5i i mindre brønde, såsom "8-godt kammer slides" (BD 354628) eller "CultureWell" (Sigma C7735-20EA).
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Francisco Candal, CDC Technology Transfer Office, Atlanta Georgia for HBEC-5i celler. Dette arbejde blev finansieret af Wellcome Trust (4 årige ph.d. studentship til AC og Senior Fellowship i Basic Biomedical Science til JAR, yde nummer 084226).