Un<em> In vitro</em> Modelo para el secuestro de la malaria cerebral se describe<sup> 1</sup>.<em> Plasmodium falciparum</em> Los glóbulos rojos infectados son seleccionados para unirse al inmortalizado células del cerebro humano endoteliales microvasculares. Los parásitos seleccionados muestran un fenotipo distinto. El proceso de selección pueden ser aplicados utilizando diversos<em> P. falciparum</em> Cepas y líneas de células endoteliales.
La mayoría de las muertes por malaria humana es causada por el Plasmodium estadio en sangre los parásitos P. falciparum. La malaria cerebral, la complicación más mortal de la enfermedad, se caracteriza por una acumulación de Plasmodium falciparum los glóbulos rojos infectados (iRBC) en la etapa de trofozoíto pigmentadas en la microvasculatura del cerebro 2-4. Esta obstrucción microvascular (secuestro) conduce a la acidosis, la hipoxia y perjudiciales citoquinas inflamatorias (revisado en 5). El secuestro también se encuentra en la mayoría de los tejidos microvascular del cuerpo humano 2, 3. El mecanismo por el cual iRBC adhieren a las paredes de los vasos sanguíneos aún es poco conocido.
La línea inmortalizada Humanos microvascular cerebral de células endoteliales (HBEC-5i) ha sido utilizado como un modelo in vitro de la barrera sangre-cerebro 6. Sin embargo, el Plasmodium falciparum iRBC adjuntar sólo poco a HBEC-5i in vitro, a diferencia de la densa sequestrationes que se produce en los casos de malaria cerebral. Por lo tanto, desarrolló un ensayo panorámico para seleccionar (enriquecer) varias P. falciparum cepas para la adhesión a HBEC-5i para obtener poblaciones de alto vinculante parásitos, más representativo de lo que ocurre in vivo.
Una muestra de un cultivo de parásitos (mezcla de iRBC y no infectados RBC) en la fase de trofozoito pigmentadas se lava y se incubaron en una capa de HBEC-5i cultivadas en una placa de Petri. Después de la incubación, el plato está cuidadosamente lavados de uRBC iRBC y no consolidados. Fresco uRBC se añaden a la iRBC pocas condiciones para HBEC-5i y se incubaron durante la noche. Como los parásitos esquizonte etapa explosión, merozoitos reinvade RBC y los parásitos en el estadio de anillo se cosechan al día siguiente. Los parásitos se cultivan hasta que se obtiene material suficiente (generalmente de 2 a 4 semanas) y una nueva ronda de selección se puede realizar. Dependiendo de la P. falciparum cepa, de 4 a 7 rondas de selección son necesarios para obtener una poblacióndonde la mayoría de los parásitos se unen a HBEC-5i. El fenotipo de la unión se pierde progresivamente a las pocas semanas, lo que indica un cambio en la expresión del gen del antígeno de superficie variante, por lo tanto la selección regular de HBEC-5i es necesaria para mantener el fenotipo.
En resumen, hemos desarrollado un ensayo de selección de la representación P. falciparum parásitos más "adhesivo malaria cerebral" fenotipo. Hemos sido capaces de seleccionar 3 de cada 4 P. falciparum cepas de HBEC-5i. Este ensayo también ha sido utilizado con éxito para seleccionar los parásitos de la unión a las células endoteliales humanas dérmicas y pulmonares. Es importante destacar que este método puede ser usado para seleccionar tejidos específicos poblaciones de parásitos a fin de identificar ligandos candidato parásito para la unión al endotelio cerebral. Por otra parte, este ensayo puede ser utilizado para detectar el supuesto secuestro de medicamentos anti-7.
El sello distintivo de la malaria cerebral es la retención de P. falciparum iRBC dentro del cerebro microvasculatura 2, 3. Sin embargo, en cultivos in vitro de P. falciparum sólo poco a cytoadhere HBEC-5i, un modelo para el endotelio microvascular cerebro humano. Aquí hemos desarrollado un ensayo sencillo para enriquecer a una población de la unión a HBEC-5i, uno más "in-vivo como" fenotipo. Tres de cada 4 P. cepas de P. falciparum se han seleccionado con éxito utilizando este método. Además, HB3 también fue seleccionado en HDMEC y HPMEC, lo que indica que este protocolo se puede utilizar para los parásitos y diversos tipos de células endoteliales.
Diferentes hipótesis pueden explicar la falta de unión con la cepa Dd2. La más probable es que el hecho de que esta línea parásito sin botón, lo que impide la profunda cytoadherence 13, 14.
Se recomienda el cultivo de parásitos seleccionados junto a la selección de proproceso para proporcionar un control de comparación. Esto permitirá, por ejemplo, comparar el transcriptoma de los parásitos vinculantes y no vinculantes, con la esperanza de descubrir los candidatos parásito ligando.
TNF es una citocina encontrado a un alto nivel en los pacientes con paludismo cerebral y ha sido mostrar a inducir la expresión de proteínas de la superficie muchos de HBEC-5i (Claessens et al, en preparación y 8, 15, 16). En este caso, la cantidad de iRBC obligado fue similar en condiciones normales HBEC-5i en comparación con el activo HBEC-5i.
Este "modelo de secuestro", también se puede utilizar para estudiar la interacción molecular entre el iRBC y las células endoteliales, así como el efecto de la supuesta cytoadherence anti-drogas. En este caso, se recomienda placas HBEC-5i en pequeños pozos, tales como la "cámara de diapositivas de 8 pocillos" (BD 354 628) o "CultureWell" (Sigma C7735-20EA).
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Francisco Candal, CDC Oficina de Transferencia de Tecnología, Georgia Atlanta para HBEC-5i células. Este trabajo fue financiado por el Wellcome Trust (4 años las becas para estudios de doctorado a la CA y la Beca Superior en Ciencias Biomédicas Básicas de JAR, número de concesión 084226).