Summary
一个
Abstract
大多数人患疟疾死亡血阶段的恶性疟原虫的寄生虫引起的。脑型疟疾，最危及生命的并发症的疾病，特点是由恶性疟原虫感染的红血球细胞色素滋养体阶段大脑微血管 2-4（iRBC）的积累。这微血管阻塞（封存），导致酸中毒，缺氧和有害的炎性细胞因子（审查5 ）。封存还发现，在人体2，3最微血管组织。其中iRBC附着于血管壁的机制仍然知之甚少。
永生化人脑微血管内皮细胞株（HBEC 5I）已被用来作为一个在体外血脑屏障模型。然而， 恶性疟原虫 iRBC附加只有糟糕HBEC - 5I 在体外 ，不像密集sequestrat离子在脑疟疾病例发生。因此，我们开发了一个平移检测选择（丰富）各种体育为了获得高约束性寄生虫，更能代表体内发生的人口恶性疟原虫株粘附HBEC - 5I。
寄生虫文化的一个样品色素滋养体阶段（iRBC和未受感染的红细胞混合物）洗涤和孵育生长在培养皿上HBEC - 5I层。孵化后，菜是轻轻洗涤uRBC和未绑定iRBC。新鲜uRBC添加到少数iRBC HBEC - 5i和孵育过夜。裂殖阶段寄生虫爆裂，裂殖子reinvade红细胞和这些环阶段的寄生虫是收获的翌日。寄生虫培养，直到获得足够的材料（一般为2至4周），并可以进行新一轮的选择。根据不同的 P. 恶性疟原虫株，需要4至第7轮的选择，以获得一个人口大多数寄生虫绑定HBEC - 5I。几个星期后，正逐步失去约束力的表型，说明变异表面抗原基因表达的开关，从而需要保持经常选择HBEC - 5I的表型。
综上所述，我们开发了一种选择检测呈现P.恶性疟原虫的寄生虫更“脑型疟疾的粘合剂”表型。我们能够选择4 P. 3 恶性疟原虫株HBEC - 5I。此实验也成功地被用来选择对人体皮肤和肺血管内皮细胞结合的寄生虫。更重要的是，这种方法可以用来选择组织特异性寄生虫种群，以确定寄生虫配体结合脑血管内皮细胞的候选人。此外，该法可用于屏幕上公认的反封存药品7。
Protocol
一般建议
人类大脑微血管内皮细胞（HBEC 5I）文化已先前所描述的6，8，P. 9， 培养恶性疟原虫的寄生虫。 HBEC - 5i和P.恶性疟原虫文化应保持在无菌条件下在任何时候都。所有试剂应在37 ° C预热我们建议定期检查支原体污染的PCR（Minevera Biolabs公司，以下制造商的指示）10。该协议是在图1总结。
1。内皮细胞常规培养
- 准备必要的试剂。
| 中等至准备 | 试剂 | 数量 |
| “DMEM培养液不完整” | DMEM - F12火腿 | 500毫升 |
| ＆NBSP; | L -谷氨酰胺200MM | 5毫升 |
| 青霉素/链霉素100X | 5毫升 | |
| 氢氧化钠1M | 1.3毫升（调整pH至7.4） | |
| “DMEM完全” | “DMEM培养液不完整” | 450毫升 |
| 胎儿牛血清热灭活 | 50毫升 | |
| 内皮细胞生长补充 | 5毫升 |
- 在通风25厘米2瓶用10ml的DMEM完全培养基用5％的CO 2在37℃培养箱文化HBEC - 5I。
- 当他们成为融合的传代细胞。由吸删除旧的介质和洗两次使用DMEM不完全介质或组织文化品位PBS（Ca 2 +和Mg 2 +的自由）预热至37 ° C。
- 新增的预热尝试1毫升psin - EDTA（0.025％胰蛋白酶，EDTA的0.5MM），覆盖整个烧瓶，在37〜2分钟的漩涡° C。
- 倒置显微镜下检查，已至少有90％的细胞分离。如果有必要，轻轻敲烧瓶底部打跑贴壁细胞。加入DMEM完全培养基15毫升锥形管的胰蛋白酶和转让细胞块10毫升。离心机在室温（RT）为300 克 4分钟。
- 弃上清，悬浮颗粒的DMEM完全培养基用10ml。移液器向上和向下的解决方案，彻底悬浮细胞。
- 1或2毫升细胞悬液加入到一个新的培养瓶中，并添加新鲜培养基8毫升保持文化。每天倒置显微镜下评估文化的发展和改变介质的每2或3天，才变成黄色。
2。准备选择的内皮细胞
- 前两天的SelectIO的日子 N，添加纤维连接蛋白在无菌PBS（2微克/厘米2）在一个（或更多）60毫米培养皿稀释。 5至20分钟的菜在37 ° C，然后删除纤维连接蛋白的解决方案，一个月在4 ° C，可存储和重新使用一次。
- 第1.3代细胞。到1.5。假设100％的融合细胞的分离和重新悬浮于10ml DMEM完全培养基（1.6节，与等量的培养基悬浮汇合是较低的，例如悬浮8毫升如果汇合率为80％），添加悬浮1.5毫升细胞纤维连接蛋白涂层的培养皿和另一个DMEM完全培养基1.5毫升。
- 将在孵化器的种子培养皿。注：在理想的情况下，汇合将在选择的时间在90％左右，两天后。
- 可选 。要激活HBEC - 5I，添加在选择前的终浓度为50μg/ml24小时的TNF（肿瘤坏死因子）细胞因子。
- 准备必要的试剂（见表这里下）。人体红细胞（RBC）的分离通过全血（O组+），通过过滤器（见“疟疾研究方法”的出版，对于一般的疟疾寄生虫培养11）白细胞耗竭准备。两次离心5分钟为400 克和resuspending他们用10 ml的RPMI不全，洗涤红细胞。洗涤红细胞保持在4 ° C时，在不完整的中型50％血细胞比容。
| 中等至准备 | 试剂 | 数量 |
| “不完整的RPMI” | RPMI 1640（与碳酸氢钠） | 500毫升 |
| HEPES 1M | 12.5毫升 | |
| 葡萄糖20％ | 5毫升 | |
| L -谷氨酰胺200MM | 5毫升 | |
| 庆大霉素50mg/ml | 250μl | |
| 氢氧化钠1M | 0.7毫升（调节pH值至7.2） | |
| “的RPMI完成” | “不完整的RPMI” | 450毫升 |
| 汇集人类（非）血清免疫 | 50毫升 |
- 文化体育恶性疟原虫感染的红细胞的RPMI完全培养基在2％的血细胞比容和孵化在37 ° C与1％O 2，CO 2，3％和96％N 2 。吉姆萨涂抹11日，以评估寄生虫（图2）发展阶段。
- 定期（约每周一次）文化同步山梨醇治疗12。这一天之前选择检测，环形舞台文化的目的，在5％或更多的寄生虫血症（最好至少10％）。
4。 P 的选择为cytoadhesion内皮细胞的恶性
- 在一天的检测，寄生虫的文化应在HBEC - 5I文化色素滋养体阶段（ 图2）（理想10％的寄生虫血症），而应在50％至100％汇合（理想的90 ％）。每HBEC - 5I培养皿30μl包装细胞体积寄生虫文化需要。
- 两次离心5分钟（500 克 ）寄生虫文化1.5毫升洗净寄生虫。弃上清，重悬新鲜的，温暖，DMEM不完全介质10毫升。重复洗第二次。悬浮与1.5毫升30μl包装不完整，用1％BSA的DMEM细胞体积。
- 洗HBEC - 5I涂布培养皿两次吸气中期和不完整的DMEM加入3毫升。
- 添加到HBEC - 5I菜和孵化的解决方案，寄生虫在37℃为75分钟彗星。两次重悬寄生虫在潜伏期（30和60分钟后）在四个方向，以及顺时针和反时针方向轻轻摇晃菜。
- 孵育后，洗净的菜吸气中期的5倍，使用塑料巴斯德吸管加入3毫升温暖的DMEM不完全介质的，温和的摇摆。如果正在使用的许多菜肴，保持在一个温暖的表面，如装满了水在37大烧瓶° C。
- 检查倒置显微镜下的菜。如果有很多未受感染的红细胞仍然可见，做如上所述的清洗。处理培养皿中非常小心，以避免任何污染风险。
- 从盘中取出中期和温暖的RPMI完全培养基添加新鲜uRBC包装细胞体积40μl3毫升。
- 放置在密闭的孵化室的菜，气3分钟，并将其放置在37℃过夜在一个孵化室。
- 后的第二天，收获洗衣机用RPMI不完整的培养基，以类似的方式，如4.4节所述的寄生虫。但更积极。记p的所有介质（含悬浮红细胞）在15毫升锥形管。倒置显微镜下检查，所有RBC已经从菜中删除。
- 颗粒的寄生虫，弃上清，悬浮5毫升的RPMI完全培养基和地方在正常培养瓶的混合物。
5。代表性的成果
未选中的寄生虫显示一个有约束力的HBEC - 5I（图3A）的低水平。因此，第一轮选拔后，极少数的寄生虫会有所收获，它可能需要长达一个月的培养，以达到足够的寄生虫血症的第二轮选择。每一轮选择后，越来越多的寄生虫内皮细胞结合的选择，可以在较短的时间间隔重复。经过4-5轮筛选，获得高约束力的寄生虫种群（图3）。
在我们的手中，HB3，HBEC结合HBEC - 5i或肿瘤坏死因子激活HBEC - 5I的SIM卡ILAR水平（数据未显示）。
这里描述的协议进行了测试，4 P。恶性疟原虫株：HB3，IT/FCR3，3D7和DD2（见表1）。只有后者被证明不能绑定到HBEC - 5I，即使经过5轮选拔。
HB3寄生虫也选择cytoadherence人体皮肤和肺微血管内皮细胞（HDMEC和HPMEC）。经过4轮选拔，使用方法这里描述的，高约束力的人口获得HDMEC和HPMEC（图4）。
图1。选拔过程的概述。
图2 P 的发展阶段。 恶性疟原虫感染的红细胞。吉姆萨涂片观察显微镜下的1000倍放大倍率。
图3。寄生虫HBEC - 5I结合的典型例子。 （一）蓝色层HBEC - 5I戊二醛固定，用姬姆萨染色，在显微镜下可视化1000X放大倍率。照片拍摄后uRBC和未绑定iRBC被洪水冲走。左侧面板显示一个单一的体育恶性 HB3（未选中）寄生虫势必HBEC - 5I。在右侧面板，HB3 HBEC寄生虫已被选定为5个回合。 （b）数据代表两个独立的实验，每次重复执行的平均水平。开往每内皮细胞的寄生虫数量计算。
表1。摘要恶性疟原虫株已成功HBEC - 5I。注意结合 ，HB3也TNF激活HB选择选择EC - 5I。经过5轮筛选，DD2应变均没有约束力HBEC - 5I比未选中- DD2增加。
图4。 体育绑定恶性 HB3寄生虫真皮（HDMEC）和肺（HPMEC）内皮细胞前后4轮的选择，。虽然培养液中HDMEC和HPMEC略有不同（见供应商的说明），选择的协议是与相同HBEC - 5I。 400X的放大倍率拍照留念。
| 试剂名称 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
| DMEM - F12火腿 | 西格玛 | D6421 | 对于DMEM完全培养基 |
| L -谷氨酰胺200MM | GIBCO公司 | 25030 | 对于DMEM和RPMI完全培养基 |
| 青霉素/链霉素100X（10000单位/ ml和10mg/ml的） | ScienCell | 0503 | 对于DMEM完全培养基 |
| 胎儿牛血清热灭活 | ScienCell | 0025 | 对于DMEM完全培养基 |
| 胰蛋白酶- EDTA（0.025％胰蛋白酶，EDTA的0.5MM） | ScienCell | 0103 | |
| 内皮细胞生长补充 | ScienCell | 1052 | 对于DMEM完全培养基 |
| 组织培养处理60毫米× 15毫米培养皿 | 屋宇署 | 353002 | |
| 人纤维连接蛋白 | Millipore公司 | FC010 | 使用2微克/厘米2 |
| 肿瘤坏死因子 | 研发D系统 | 210 - TA | 可选的，使用50微克/毫升 |
| RPMI 1640培养 | 龙沙 | BE12 - 167F | 对于RPMI完全培养基 |
| 庆大霉素50mg/ml | 龙沙 | 17 - 518Z | 对于RPMI完全培养基 |
| HEPES 1M | 龙沙 | BE17 - 737E | 对于RPMI完全培养基 |
| HDMEC | ScienCell | 2000 | 主细胞株 |
| HPMEC | ScienCell | 3000 | 主细胞株 |
| HBEC - 5I | 获得旧金山康达尔（fcandal@cdc.gov） |
表2。
Discussion
脑型疟疾的特点是体育封存恶性 iRBC大脑内的微血管2，3。然而， 在体外培养的P.恶性不佳cytoadhere HBEC - 5I，人类大脑微血管内皮细胞模型。在这里，我们开发了一个简单的检测，以丰富HBEC - 5I结合，更表现型“一样在体内”的人口。三出4 P。恶性疟原虫株成功地使用这种方法选择。此外，HB3也HDMEC和HPMEC选择，这表明，这个协议可以用于各种寄生虫和内皮细胞类型。
不同的假设可以解释的缺乏约束力DD2应变。最有可能的事实，这种寄生虫线knobless，它深刻地阻碍了cytoadherence 13，14 。
我们建议选择亲一起培养未选中的寄生虫塞斯提供比较控制。例如，这将使比较转录的约束性和非约束性的寄生虫，发现寄生虫配位候选人的希望。
TNF是在高级别脑型疟疾患者中发现一种细胞因子，并已显示诱导HBEC - 5I（ 克拉森等人，在准备和8，15，16）的表面蛋白的表达。在这种情况下，势必iRBC金额是在正常的HBEC - 5I相似，而激活HBEC - 5I。
这种“封存模式”也可以用来研究iRBC和内皮细胞之间的分子间相互作用，以及公认的反cytoadherence药物的效果。在这种情况下，我们建议在较小的井，如“8以及玻片”（BD 354628）或“CultureWell”（Sigma公司C7735 - 20EA），电镀HBEC - 5I。
Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
我们感谢HBEC - 5I细胞旧金山康达尔，技术转让办公室，乔治亚州亚特兰大疾病预防控制中心。这项工作是由威康信托基金会（4年博士助学金交流，并在基础生物医学科学高级研究金的JAR，授予编号084226）。
References
- Scherf, A. Antigenic variation in malaria: in situ switching, relaxed and mutually exclusive transcription of var genes during intra-erythrocytic development in Plasmodium falciparum. Embo. J. 17, 5418-5426 (1998).
- MacPherson, G. G., Warrell, M. J., White, N. J., Looareesuwan, S., Warrell, D. A. Human cerebral malaria. A quantitative ultrastructural analysis of parasitized erythrocyte sequestration. Am. J. Pathol. 119, 385-401 (1985).
- Seydel, K. B., Milner, D. A., Kamiza, S. B., Molyneux, M. E., Taylor, T. E. The distribution and intensity of parasite sequestration in comatose Malawian children. J. Infect. Dis. 194, 208-208 (2006).
- Taylor, T. E. Differentiating the pathologies of cerebral malaria by postmortem parasite counts. Nat. Med. 10, 143-145 (2004).
- van der Heyde, H. C., Nolan, J., Combes, V., Gramaglia, I., Grau, G. E. A unified hypothesis for the genesis of cerebral malaria: sequestration, inflammation and hemostasis leading to microcirculatory dysfunction. Trends. Parasitol. 22, 503-508 (2006).
- Dorovini-Zis, K., Prameya, R., Bowman, P. D. Culture and characterization of microvascular endothelial cells derived from human brain. Lab. Invest. 64, 425-436 (1991).
- Rowe, J. A., Claessens, A., Corrigan, R. A., Arman, M. Adhesion of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes to human cells: molecular mechanisms and therapeutic implications. Expert reviews in molecular medicine. 11, e16-e16 (2009).
- Xiao, L. Plasmodium falciparum: involvement of additional receptors in the cytoadherence of infected erythrocytes to microvascular endothelial cells. Exp. Parasitol. 84, 42-55 (1996).
- Corrigan, R. A., Rowe, J. A. Strain variation in early innate cytokine induction by Plasmodium falciparum. Parasite. Immunol. 32, 512-527 (2010).
- Rowe, J. A. Implications of mycoplasma contamination in Plasmodium falciparum cultures and methods for its detection and eradication. Mol. Biochem. Parasitol. 92, 177-180 (1998).
- Moll, K., Ljungström, I., Perlmann, H., Scherf, A., Wahlgren, M. Methods in Malaria Research. , MR4/ATCC. (2009).
- Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. J. Parasitol. 65, 418-420 (1979).
- Herricks, T., Antia, M., Rathod, P. K. Deformability limits of Plasmodium falciparum-infected red blood cells. Cell. Microbiol. , (2009).
- Nakamura, K., Hasler, T., Morehead, K., Howard, R. J., Aikawa, M. Plasmodium falciparum-infected erythrocyte receptor(s) for CD36 and thrombospondin are restricted to knobs on the erythrocyte surface. J. Histochem. Cytochem. 40, 1419-1422 (1992).
- Wassmer, S. C., Cianciolo, G. J., Combes, V., Grau, G. E. LMP-420, a new therapeutic approach for cerebral malaria. Med. Sci. (Paris). 22, 343-345 (2006).
- Wassmer, S. C., Combes, V., Candal, F. J., Juhan-Vague, I., Grau, G. E. Platelets potentiate brain endothelial alterations induced by Plasmodium falciparum. Infect. Immun. 74, 645-653 (2006).
