का चयन प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम Cytoadhesion के लिए परजीवियों

Summary

एक<em> इन विट्रो में</em> मॉडल मस्तिष्क मलेरिया ज़ब्ती के लिए वर्णित है¹.<em> प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम</em> संक्रमित लाल रक्त कोशिकाओं अमर मानव मस्तिष्क microvascular endothelial कोशिकाओं के लिए बाध्य करने के लिए चयन कर रहे हैं. चयनित परजीवी एक अलग phenotype दिखा. चयन प्रक्रिया के विभिन्न का उपयोग कर लागू किया जा सकता है<em> पी. फाल्सीपेरम</em> उपभेदों और endothelial कोशिका लाइनों.

Abstract

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the disease, is characterised by an accumulation of Plasmodium falciparum infected red blood cells (iRBC) at pigmented trophozoite stage in the microvasculature of the brain^2-4. This microvessel obstruction (sequestration) leads to acidosis, hypoxia and harmful inflammatory cytokines (reviewed in ⁵). Sequestration is also found in most microvascular tissues of the human body^{2, 3}. The mechanism by which iRBC attach to the blood vessel walls is still poorly understood.

The immortalized Human Brain microvascular Endothelial Cell line (HBEC-5i) has been used as an in vitro model of the blood-brain barrier⁶. However, Plasmodium falciparum iRBC attach only poorly to HBEC-5i in vitro, unlike the dense sequestration that occurs in cerebral malaria cases. We therefore developed a panning assay to select (enrich) various P. falciparum strains for adhesion to HBEC-5i in order to obtain populations of high-binding parasites, more representative of what occurs in vivo.

A sample of a parasite culture (mixture of iRBC and uninfected RBC) at the pigmented trophozoite stage is washed and incubated on a layer of HBEC-5i grown on a Petri dish. After incubation, the dish is gently washed free from uRBC and unbound iRBC. Fresh uRBC are added to the few iRBC attached to HBEC-5i and incubated overnight. As schizont stage parasites burst, merozoites reinvade RBC and these ring stage parasites are harvested the following day. Parasites are cultured until enough material is obtained (typically 2 to 4 weeks) and a new round of selection can be performed. Depending on the P. falciparum strain, 4 to 7 rounds of selection are needed in order to get a population where most parasites bind to HBEC-5i. The binding phenotype is progressively lost after a few weeks, indicating a switch in variant surface antigen gene expression, thus regular selection on HBEC-5i is required to maintain the phenotype.

In summary, we developed a selection assay rendering P. falciparum parasites a more “cerebral malaria adhesive” phenotype. We were able to select 3 out of 4 P. falciparum strains on HBEC-5i. This assay has also successfully been used to select parasites for binding to human dermal and pulmonary endothelial cells. Importantly, this method can be used to select tissue-specific parasite populations in order to identify candidate parasite ligands for binding to brain endothelium. Moreover, this assay can be used to screen for putative anti-sequestration drugs⁷.

Protocol

जनरल सिफारिशें मानव मस्तिष्क microvascular endothelial सेल संस्कृति (HBEC 5ï) पहले किया गया है 6 में वर्णित, 8 पी.. फाल्सीपेरम परजीवी 9 के रूप में सुसंस्कृत थे . दोनों HBEC 5ï और पी. फाल्सीपेरम परजीवी संस्कृतियों सभी समय बाँझ परिस्थितियों में रखा जाना चाहिए. सभी अभिकर्मकों होना चाहिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व गरम हम पीसीआर (Minevera Biolabs, निम्नलिखित निर्माता के निर्देशों) द्वारा mycoplasma 10 संदूषण के लिए नियमित रूप से जाँच की सलाह देते हैं. प्रोटोकॉल चित्रा 1 में सारांशित है. 1. Endothelial सेल दिनचर्या संस्कृति आवश्यक अभिकर्मकों की तैयारी. तैयार मध्यम अभिकर्मकों मात्रा "अधूरा DMEM" हाम DMEM-F12 500ml औरnbsp; एल glutamine 200mm 5ml पेनिसिलीन / 100X स्ट्रेप्टोमाइसिन 5 मिलीलीटर NaOH 1M 1.3 मिलीलीटर (7.4 करने के लिए पीएच समायोजित) "पूरा DMEM" "अधूरा DMEM" 450ml Foetal गोजातीय सीरम गर्मी निष्क्रिय 50ml Endothelial सेल वृद्धि पूरक 5 मिलीलीटर 5% सीओ 2 के साथ 10ml DMEM एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में पूरा मध्यम के साथ दिए 25cm 2 फ्लास्क में HBEC 5ï संस्कृति . पारित होने कोशिकाओं जब वे सहधारा हो. चूषण द्वारा पुराने मध्यम निकालें और दो ​​बार धोने DMEM अधूरा मध्यम या टिशू कल्चर ग्रेड पीबीएस (2 Ca + मिलीग्राम और 2 + मुक्त) 37 पूर्व गरम डिग्री सेल्सियस का उपयोग पूर्व गर्म की कोशिश करो के 1ml जोड़ेंpsin – EDTA (0.025% trypsin, 0.5mm EDTA), कुप्पी की सम्पूर्णता को कवर करने के लिए और 37 पर ~ 2 मिनट के लिए सेते ज़ुल्फ़ ° सी. उलटा माइक्रोस्कोप के तहत की जाँच करें कि कोशिकाओं के कम से कम 90% अलग किया गया है. यदि आवश्यक हो, धीरे कुप्पी के नीचे दस्तक करने के लिए पक्षपाती कोशिकाओं को बेदखल. DMEM पूरा एक 15ml शंक्वाकार ट्यूब में trypsin और हस्तांतरण कोशिकाओं ब्लॉक मध्यम 10ml जोड़ें. कमरे के तापमान (आरटी) में 300 ग्राम में 4 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र . सतह पर तैरनेवाला त्यागें और DMEM पूरा माध्यम से 10ml के साथ गोली resuspend. समाधान विंदुक ऊपर और नीचे अच्छी तरह से कोशिकाओं resuspend. एक नई संस्कृति फ्लास्क में सेल निलंबन के 1 या 2 मिलीलीटर जोड़ें और ताजा माध्यम के 8ml जोड़ने के लिए संस्कृति को बनाए रखने. संस्कृति विकास हर दिन और एक औंधा माइक्रोस्कोप के अंतर्गत आकलन मध्यम बदलने के हर 2 या 3 दिन पहले यह पीले रंग बदल जाता है. 2. चयन के लिए endothelial कोशिकाओं की तैयारी Selectio के दिन पहले दो दिन n, एक (या अधिक) 60 मिमी पेट्री डिश में बाँझ पीबीएस (2 μg / 2 सेमी) में पतला fibronectin जोड़ें. 37 पर 5 से 20 मिनट के लिए पकवान सेते डिग्री सेल्सियस, तो fibronectin समाधान है, जो 4 ° C पर एक महीने के लिए भंडारित किया जा सकता है और एक बार फिर से इस्तेमाल किया हटायें. पारित होने कोशिकाओं के रूप में 1.3 वर्गों में में वर्णित है. 1.5 से. मान लिया जाये कि 100% सहधारा कोशिकाओं अलग थे और 10ml DMEM पूरा मध्यम (1.6 अनुभाग में, मध्यम के एक बराबर मात्रा के साथ resuspend अगर confluency कम है, जैसे 8ml साथ resuspend अगर confluency 80% था) में resuspended, निलंबित 1.5ml जोड़ने fibronectin लेपित पेट्री डिश और DMEM पूरा मध्यम के एक 1.5ml कोशिकाओं. इनक्यूबेटर में वरीयता प्राप्त पेट्री डिश रखें. नोट: आदर्श रूप में, 90% के आसपास confluency चयन के समय में दो दिन बाद किया जाएगा. वैकल्पिक. HBEC-5ï सक्रिय करने के लिए, 50μg/ml 24 घंटे की एक अंतिम चयन के लिए पहले एकाग्रता में TNF साइटोकाइन (ट्यूमर परिगलन कारक) जोड़ें. e_title "> 3. प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम दिनचर्या संस्कृति आवश्यक अभिकर्मकों (तालिका देखें के तहत यहाँ) तैयार करें. ल्युकोसैट रिक्तीकरण फिल्टर (सामान्य मलेरिया परजीवी के संवर्धन के लिए 11 प्रकाशन "मलेरिया अनुसंधान में तरीके" देखें) के माध्यम से पारित होने से पूरे रक्त (समूह ओ +) को अलग से मानव लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) की तैयारी. आरबीसी धो दो बार 5 मिनट के लिए 400 ग्राम centrifuging और उन्हें 10 मिलीलीटर अधूरा RPMI के साथ resuspending . 4 में धोया आरबीसी रखें ° अधूरा मध्यम में 50% हेमाटोक्रिट सी. तैयार मध्यम अभिकर्मकों मात्रा "अधूरा RPMI" RPMI 1640 (बिकारबोनिट के साथ) 500ml Hepes 1M 12.5ml 20% ग्लूकोज 5ml </p> एल glutamine 200mm 5ml Gentamycin 50mg/ml 250μl NaOH 1M 0.7 मिलीलीटर (7.2 करने के लिए पीएच समायोजित) "RPMI पूरा" "अधूरा RPMI" 450ml मानव (गैर प्रतिरक्षा) सीरम जमा 50ml संस्कृति पी. RPMI 37 पर 2% hematocrit और सेते पर पूरा मध्यम ° सी 3% 2 सीओ, 1% 2 हे, और 96% एन 2 के साथ साथ फाल्सीपेरम संक्रमित आरबीसी Giemsa 11 स्मियर दैनिक परजीवी (चित्रा 2) के विकास की अवस्था का आकलन करें . नियमित रूप से (लगभग सप्ताह में एक बार) sorbitol 12 उपचार द्वारा संस्कृति सिंक्रनाइज़. दिन पूर्व चयन परख, एक संस्कृति की अंगूठी चरण के लिए 5% parasitaemia या अधिक उद्देश्य (आदर्श कम से कम 10%). 4. पी. के चयन endothelial कोशिकाओं को cytoadhesion के लिए फाल्सीपेरम परख के दिन पर, परजीवी संस्कृति pigmented trophozoite (चित्रा 2) मंच (आदर्श 10% parasitaemia) पर हो सकता है जबकि HBEC 5ï संस्कृति 50 से 100% पर confluency (आदर्श 90%) होना चाहिए. परजीवी संस्कृति के 30μl पैक सेल मात्रा प्रति HBEC-5ï पेट्री डिश की जरूरत है. Centrifuging (5 मिनट के लिए 500 ग्राम) परजीवी संस्कृति के 1.5ml द्वारा परजीवी दो बार धो. सतह पर तैरनेवाला और हौसले से बनाया, गरम, DMEM अधूरा मध्यम 10ml के साथ resuspend त्यागें. धोने दूसरी बार दोहराएँ. 30μl 1.5ml के साथ 1% BSA के साथ अधूरा DMEM के पैक सेल मात्रा Resuspend. HBEC 5ï लेपित पेट्री दो बार मध्यम aspirating और अधूरा DMEM के 3ml जोड़ने पकवान धो लें. परजीवी के 37 HBEC-5ï पकवान और सेते ° समाधान सी 75min के लिए जोड़ें. परजीवी ऊष्मायन के दौरान दो बार (30 और 60 मिनट के बाद) Resuspendधीरे चार दिशाओं के रूप में के रूप में अच्छी तरह से दक्षिणावर्त और विरोधी दक्षिणावर्त में पकवान कमाल. ऊष्मायन के बाद, पकवान माध्यम aspirating से 5 बार धो, एक प्लास्टिक पाश्चर पिपेट का उपयोग करने के लिए गर्म DMEM अधूरा मध्यम 3 मिलीग्राम, और कोमल कमाल जोड़ने. यदि कई व्यंजनों का इस्तेमाल किया जा रहा है, उन्हें 37 पर पानी से भरा एक बड़े फ्लास्क डिग्री सेल्सियस के रूप में एक गर्म सतह पर रखने एक औंधा खुर्दबीन के नीचे पकवान की जाँच करें. यदि कई असंक्रमित आरबीसी अभी भी दिखाई दे रहे हैं, अधिक washes के रूप में ऊपर वर्णित करते हैं. पेट्री डिश बहुत सावधानी से संभाल संदूषण के किसी भी जोखिम से बचने के लिए. मध्यम पकवान से निकालें और गर्म RPMI पूरा मध्यम 3ml जोड़ने 40μl पैक ताजा uRBC के सेल की मात्रा के साथ. एक airtight incubating कक्ष में पकवान, गैस 3 मिनट के लिए रखें और 37 ° रातोंरात सी पर एक इनक्यूबेटर में चैम्बर जगह. दिन के बाद, RPMI अधूरा मध्यम के साथ धोने, खंड 4.4 में वर्णित के रूप में एक समान तरीके में परजीवी फसल. लेकिन और अधिक तेजी से. Keeपी सभी मध्यम 15ml शंक्वाकार ट्यूब में इस्तेमाल किया (आरबीसी resuspended युक्त). उलटा माइक्रोस्कोप के तहत की जाँच करें कि सभी आरबीसी पकवान से हटा दिया गया है. गोली परजीवी, सतह पर तैरनेवाला, 5ml RPMI पूरा मध्यम और जगह सामान्य संवर्धन के लिए एक कुप्पी में मिश्रण में resuspend त्यागें. 5. प्रतिनिधि परिणाम विचयनित परजीवी HBEC 5ï (चित्रा 3A) के लिए बाध्य की एक कम स्तर दिखा. इस प्रकार, चयन के पहले दौर के बाद, बहुत कुछ परजीवी और काटा जाएगा यह संवर्धन के एक महीने के लिए लेने के लिए एक चयन के दूसरे दौर के लिए पर्याप्त parasitaemia तक पहुँच सकते हैं. चयन के प्रत्येक दौर के बाद, अधिक से अधिक परजीवी endothelial कोशिकाओं के लिए बाध्य चयन और कम समय के अंतराल पर दोहराया जा सकता है. चयन के 4-5 राउंड के बाद, उच्च बाध्यकारी परजीवी आबादी (चित्रा 3) प्राप्त कर रहे हैं. हमारे हाथ में, HB3 – HBEC के HBEC 5ï या TNF HBEC 5ï सक्रिय के लिए बाध्य सिम की थीilar स्तर (नहीं दिखाया डेटा है). प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित पी. 4 के साथ परीक्षण किया गया था फाल्सीपेरम उपभेदों: HB3, IT/FCR3, 3D7 और Dd2 (तालिका 1) . केवल बाद HBEC-5ï के लिए बाध्य करने में सक्षम है, चयन के 5 दौर के बाद भी साबित नहीं हुआ. HB3 परजीवी भी मानव त्वचीय और फेफड़े Microvascular endothelial कोशिकाओं (HDMEC और HPMEC) cytoadherence के लिए चुना गया. के बाद चयन के 4 दौर, विधि का उपयोग कर यहाँ वर्णित है, एक उच्च बाध्यकारी जनसंख्या दोनों HDMEC और HPMEC (चित्रा 4) पर प्राप्त किया गया था. चित्रा 1 चयन प्रक्रिया का अवलोकन. चित्रा 2 पी. के विकास के चरणों फाल्सीपेरम लाल रक्त कोशिकाओं को संक्रमित . Giemsa स्मियर 1000x बढ़ाई खुर्दबीन के नीचे visualized. चित्रा 3 HBEC-5ï बाध्य परजीवी के विशिष्ट उदाहरण है . (ए) glutaraldehyde और Giemsa साथ दाग के साथ नीले रंग की परत HBEC-5ï निश्चित है, 1000x बढ़ाई खुर्दबीन के नीचे कल्पना. चित्र के बाद uRBC और अनबाउंड iRBC धुल गया लिया थे. बाईं पैनल पता चलता है एक एकल पी. फाल्सीपेरम HB3 परजीवी (छोड़ा गया) HBEC-5ï बाध्य. राइट पैनल में HB3 HBEC परजीवी 5 राउंड के लिए चुना गया था. (बी) डाटा दो स्वतंत्र प्रयोगों, प्रत्येक दो प्रतियों में प्रदर्शन के औसत का प्रतिनिधित्व करता है. endothelial सेल के प्रति बाध्य परजीवी की संख्या गिना गया. तालिका 1. प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम उपभेदों का सारांश है कि सफलतापूर्वक HBEC-5ï .. नोट करने के लिए बाध्य है कि HB3 भी TNF सक्रिय एचबी पर चुना गया था करने के लिए चयन किया गया थाचुनाव आयोग 5ï. चयन के 5 दौर के बाद, Dd2 तनाव अचयनित – Dd2 तुलना HBEC-5ï बंधन में वृद्धि नहीं दिखाया है. चित्रा 4 पी. के बंधन. फाल्सीपेरम त्वचीय (HDMEC) और फेफड़े (HPMEC) पहले और चयन के 4 दौर के बाद endothelial कोशिकाओं, के लिए परजीवी HB3. हालांकि HDMEC और HPMEC के लिए मध्यम संस्कृति थोड़ा अलग है (आपूर्तिकर्ता निर्देश देखें), चयन के लिए इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल के साथ के रूप में समान था HBEC-5ï. चित्र 400X बढ़ाई पर ले लिया है. अभिकर्मक के नाम कंपनी सूचीपत्र संख्या टिप्पणियाँ हाम DMEM-F12 सिग्मा D6421 DMEM पूरा मध्यम के लिए एल glutamine 200mm GIBCO 25030 DMEM और RPMI पूरा मध्यम के लिए पेनिसिलीन / 100X स्ट्रेप्टोमाइसिन (10000 इकाइयों / मिलीलीटर और 10mg/ml) ScienCell 0503 DMEM पूरा मध्यम के लिए Foetal गोजातीय सीरम गर्मी निष्क्रिय ScienCell 0025 DMEM पूरा मध्यम के लिए Trypsin EDTA (0.025% trypsin, 0.5mm EDTA) ScienCell 0103 Endothelial सेल वृद्धि पूरक ScienCell 1052 DMEM पूरा मध्यम के लिए टिशू कल्चर 60 मिमी इलाज एक्स 15 मिमी पेट्री डिश BD 353002 मानव fibronectin Millipore FC010 2 / μg 2 सेमी में प्रयोग TNF आर एंडडी सिस्टम 210-टा वैकल्पिक, 50 μg / मिलीलीटर का उपयोग 1640 RPMI Lonza BE12-167F RPMI पूरा मध्यम के लिए Gentamycin 50mg/ml Lonza 17-518Z RPMI पूरा मध्यम के लिए Hepes 1M Lonza BE17-737E RPMI पूरा मध्यम के लिए HDMEC ScienCell 2000 प्राथमिक कोशिका लाइन HPMEC ScienCell 3000 प्राथमिक कोशिका लाइन HBEC-5ï फ्रांसिस्को Candal (fcandal@cdc.gov) से प्राप्त तालिका 2 सामग्री.

Discussion

सेरेब्रल मलेरिया की पहचान पी. की ज़ब्ती मस्तिष्क ^{2 microvasculature, 3} भीतर फाल्सीपेरम iRBC. हालांकि, पी. के इन विट्रो संस्कृतियों में फाल्सीपेरम केवल खराब HBEC 5ï, मानव मस्तिष्क microvascular endothelium के लिए एक मॉडल के लिए cytoadhere . यहाँ हम एक सीधा HBEC-5ï के लिए बाध्य है, एक और अधिक phenotype "की तरह में vivo में" के लिए एक जनसंख्या समृद्ध परख विकसित किया है. 4 पी. के तीन बाहर फाल्सीपेरम उपभेदों सफलतापूर्वक इस पद्धति का उपयोग करके चयन किया गया था. इसके अलावा, HB3 भी HDMEC और HPMEC पर चुना गया था, यह दर्शाता है कि इस प्रोटोकॉल विभिन्न परजीवी और endothelial सेल प्रकार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

विभिन्न hypotheses Dd2 तनाव के साथ बंधन की कमी समझा जा सकता है. सबसे तथ्य यह है कि यह परजीवी लाइन knobless होने की संभावना है, जो ^{गहरा cytoadherence 13,} 14 में बाधा उत्पन्न करती है.

हम चयन समर्थक के साथ – साथ संवर्धन अचयनित परजीवी की सिफारिशतुलना के लिए एक नियंत्रण प्रदान उपकर. यह, उदाहरण के लिए अनुमति देते हैं, बाध्यकारी और गैर – बाध्यकारी परजीवी के transcriptome परजीवी ligand के उम्मीदवारों की खोज की आशा के साथ तुलना.

TNF एक मस्तिष्क मलेरिया के रोगियों में उच्च स्तर पर पाया साइटोकाइन है और HBEC-5ï (तैयारी में Claessens एट अल, ^{और 8, 15,} 16) के कई सतह प्रोटीन की अभिव्यक्ति को उत्पन्न करने के लिए शो किया गया है. इस मामले में, HBEC-5ï सक्रिय करने के लिए बाध्य iRBC की राशि की तुलना में सामान्य HBEC 5ï में समान था.

यह "ज़ब्ती मॉडल" भी iRBC और endothelial सेल के बीच आणविक बातचीत के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ख्यात विरोधी cytoadherence दवाओं के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस मामले में, हम HBEC 5ï "8 अच्छी तरह चैम्बर स्लाइड्स" (354,628 बी) या "CultureWell" (सिग्मा C7735-20EA) जैसे छोटे कुओं में चढ़ाना अनुशंसा करते.