Summary

L'utilisation d'un piège optique pour l'étude des interactions hôtes pathogènes pour l'imagerie cellulaire dynamique en direct

Published: July 28, 2011
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Summary

Une méthode est décrite de sélectionner individuellement, manipuler, et les agents pathogènes d'image en direct en utilisant un piège optique couplé à un microscope à disque rotatif. Le piège optique offre un contrôle spatial et temporel des organismes et les places adjacentes aux cellules hôtes. La microscopie à fluorescence capture dynamique des interactions intercellulaires avec perturbation minimale pour les cellules.

Abstract

Dynamique imagerie des cellules vivantes permet la visualisation directe des interactions en temps réel entre les cellules du système immunitaire 1, 2, cependant, le manque de contrôle spatial et temporel entre les cellules phagocytaires et de microbe a rendu concentré observations sur les interactions initiale de réponse de l'hôte aux pathogènes difficiles. Historiquement, les événements de contact intercellulaire comme la phagocytose 3 ont été imagées par mélange de deux types de cellules, puis continue la numérisation du champ de vue de trouver des contacts intercellulaires fortuite au stade approprié de l'interaction. La nature stochastique de ces événements rend ce processus fastidieux, et il est difficile d'observer des événements précoces ou fugace contact cellule-cellule par cette approche. Cette méthode nécessite de trouver des paires de cellules qui sont sur le point de contact, et les observer jusqu'à ce qu'ils consomment leur contact, ou n'en ont pas. Pour remédier à ces limitations, nous utilisons piégeage optique comme un non-invasive, méthode non destructive, mais rapide et efficace pour positionner les cellules en culture.

Pièges optiques, ou des pinces optiques, sont de plus en plus utilisés dans la recherche biologique de capturer et de manipuler physiquement les cellules et d'autres particules de taille micronique en trois dimensions 4. La pression de radiation a été observé pour la première et appliquée aux systèmes de pinces optiques en 1970 5, 6, et a d'abord été utilisée pour contrôler les échantillons biologiques en 1987 7. Depuis lors, pinces optiques ont mûri en une technologie à la sonde une variété de phénomènes biologiques 8-13.

Nous décrivons une méthode 14 que les progrès de l'imagerie cellulaire direct en intégrant un piège optique avec la filature de microscopie confocale disque avec contrôle de température et d'humidité pour fournir exquise de contrôle spatial et temporel des organismes pathogènes dans un environnement physiologique pour faciliter les interactions avec les cellules de l'hôte, tel que déterminé par le opérateur. Live, les organismes pathogènes comme Candida albicans et Aspergillus fumigatus, qui peut causer potentiellement mortels, d'infections invasives chez les personnes immunodéprimées 15, 16 (par exemple le sida, la chimiothérapie, les patients et l'orgue de transplantation), ont été piégés optiquement en utilisant des intensités laser non-destructif et déplacé à côté de macrophages, qui peuvent phagocyter l'agent pathogène. Haute résolution, transmis des films légers et basées sur la fluorescence a créé la possibilité d'observer les événements précoces de la phagocytose dans les cellules vivantes. Pour démontrer la large applicabilité de l'immunologie, les cellules T primaires ont également été piégés et manipulés pour former des synapses avec l'anti-CD3 microsphères enrobées in vivo, et imagerie time-lapse de la formation des synapses a également été obtenue. En fournissant une méthode d'exercer fines contrôle spatial de pathogènes vivants à l'égard de cellules immunitaires, les interactions cellulaires peuvent être capturés par microscopie à fluorescence avec une perturbation minimale pour les cellules et peut donner un aperçu puissante dans les réponses précoces de l'immunité innée et adaptative.

Protocol

1. Les conditions de culture de pathogènes pour le piégeage optique Cultivez A. fumigatus (B-5233/RGD12-8) sur une gélose semi-solide contenant SBD (Sabouraud dextrose) à 30 ° C pendant 3 jours. Cultivez C. albicans (SC5314) dans YPD (levure-peptone dextrose) culture liquide contenant 100 ug / ml d'ampicilline nuit dans un incubateur agité à 30 ° C. 2. Préparation des agents pathogènes pour marquage fluorescent Récolte d?…

Discussion

Dans ce travail, nous utilisons un piège optique pour capturer les agents pathogènes de dimensions comprises entre 3 um – 5 um. Bien que les agents pathogènes d'intérêt pour notre laboratoire ont généralement ces dimensions, le système de pince optique décrite ici est flexible pour piéger une large gamme de tailles. En effet pièges optiques ont été utilisés pour capturer les particules allant de simples atomes aux cellules environ 10 um de diamètre. De plus, ce système de piégeage optique était cap…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par le Massachusetts General Département Hôpital de fonds de médecine interne (JMT, MKM, le MLC, JMV), Institut national d'imagerie biomédicale et Bioingénierie octroi T32EB006348 (CCE), le Centre du Massachusetts General Hospital pour financer la biologie du développement informatique et intégrative et AI062773 ( RJH), les subventions AI062773, DK83756, et DK 043 351 (RJX), la NSF 0643745 (MJL), NIH R21CA133576 (MJL) et l'Institut national des allergies et maladies infectieuses (NIAID) des Instituts nationaux de la santé (NIH) AI057999 (JMV ). Nous remercions Nicolas C. Yoder pour les discussions utiles, et feutres Charles (RPI, Inc) pour l'assistance technique.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
A. fumigatus     Albino strain, B-5233/RGD12-8, gift from K.J. Kwon-Chung, NIH
C. albicans     SSY50-B mutant, gift from Eleftherios Mylonakis, MGH; SC5314 strain, gift from Gerald Fink, Whitehead Institute
Alexa Fluor 488 Invitrogen A20000  
Alexa Fluor 647 Invitrogen A20006  
dimethylformamide Sigma D4551  
Fresh blood     Gift from R.J.W. Heath, MGH, HMS
Nikon inverted microscope Nikon   Model Ti-E
Trapping laser, ChromaLase Blue Sky Research CLAS-106-STF02-02  
Fluorescence excitation laser Coherent   Model Innova 70C
Breadboards for trapping components Thorlabs MB1224, MB1218  
Optical air table Technical Manufacturing Corporation    
Electronic shutter with pedal control Uniblitz   Purchased from Vincent Associates, Rochester, NY
Singlemode optical fiber Oz Optics PMJ-3S3S-1064-6  
Fiber positioner Thorlabs PAF-X-5-C  
Fiber collimator Oz Optics HPUCO-23-1064-P-25AC  
Lenses for telescope Thorlabs AC254-150-B Focal length of 150 mm
Translation stages (x, y, z) Newport M-461-XYZ  
IR dichroic mirror Chroma ET750-sp-2p8  
Objective lens (100X) Nikon   NA = 1.49, oil immersion, TIRF objective
Confocal head Yokogawa CSU-XI  
Polarizer Nikon MEN51941  
Wollaston prism Nikon MBH76190  
EM-CCD camera Hamamatsu C9100-13  
CCD camera (ORCA ER) Hamamatsu C4742-80-12AG  
Filter wheel Ludl 99A353  
Filter wheel Sutter LB10-NWE  
Chambered coverglass Lab-Tek/Nunc 155409  
Dynabeads Invitrogen 111-51D Coated with anti-CD3
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Invitrogen/Gibco 10313  
Penicillin/streptomycin Invitrogen/Gibco 15140-122  
L-glutamine Invitrogen/Gibco 25030-081  
Fetal Bovine Serum (HyClone) ThermoScientific SH30071.03  

References

  1. Grakoui, A. The immunological synapse: A molecular machine controlling T cell activation. Science. 285, 221-227 (1999).
  2. Monks, C. R. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
  3. Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. Phagocytosis and comparative innate immunity: Learning on the fly. Nat Rev Immunol. 8, 131-141 (2008).
  4. Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Rev Sci Instrum. 75, 2787-2809 (2004).
  5. Ashkin, A. Optical trapping and manipulation of neutral particles using lasers. Proc Natl Acad Sci USA. 94, 4853-4860 (1997).
  6. Ashkin, A. Acceleration and trapping of particles by radiation pressure. Phys Rev Lett. 24, 156-159 (1970).
  7. Ashkin, A., Dziedzic, J. Optical trapping and manipulation of viruses and bacteria Science. Nature. 235, 1517-1520 (1987).
  8. Khalil, A. S. Single M13 bacteriophage tethering and stretching. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 4892-4897 (2007).
  9. Khalil, A. S. Kinesin’s cover-neck bundle folds forward to generate force. Proc Natl Acad Sci USA.. 105, 19247-19252 (2008).
  10. Li, Z. Membrane tether formation from outer hair cells with optical tweezers. Biophys J. , 1386-1395 (2002).
  11. Kim, S. The αβ T cell receptor is an anisotropic mechanosensor. J Biol Chem. 284, 31028-31028 (2009).
  12. Mohanty, S., Mohanty, K., Gupta, P. Dynamics of interaction of RBC with optical tweezers. Opt. Express. 13, 4745-4751 (2005).
  13. Tam, J. Control and manipulation of pathogens with an optical trap for live cell imaging of intercellular interactions. PLoS One. 5, e15215-e15215 (2010).
  14. Lin, S. J., Schranz, J., Teutsch, S. M. Aspergillosis case-fatality rate: Systematic review of the literature. Clin Infect Dis.. 32, 358-366 (2001).
  15. Wey, S. B. Hospital-acquired candidemia – the attributable mortality and excess length of stay. Arch. Intern. Med. 148, 2642-2645 (1988).

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Cite This Article
Tam, J. M., Castro, C. E., Heath, R. J. W., Mansour, M. K., Cardenas, M. L., Xavier, R. J., Lang, M. J., Vyas, J. M. Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging. J. Vis. Exp. (53), e3123, doi:10.3791/3123 (2011).

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