Summary
방법을 개별적으로 선택 조작 설명 및 이미지 라이브 병원균은 회전 디스크 현미경을 결합 광학 트랩을 사용하고 있습니다. 광학 트랩은 생물의 공간적 시간적 및 제어를 제공하며, 호스트 세포에 인접 장소. 형광 현미경은 세포에 최소한의 섭동와 역동적인 세포 상호 작용을 캡처합니다.
Abstract
동적 라이브 셀 이미징은 면역 체계 1, 2 셀 사이의 실시간 상호 작용의 직접적인 시각화를 허용하지만, phagocytic 세포와 미생물 사이의 공간 및 시간적 통제의 부족은 병원균에 호스트 응답의 초기 상호 작용에 관찰 초점을 맞추고 렌더링이 어려운. 역사적으로, 이러한 phagocytosis 3와 같은 세포 연락처 이벤트는 두 세포 유형을 혼합하여 몇 군데있다, 그리고 지속적으로 상호 작용의 적절한 단계에서 serendipitous 세포 연락처를 찾을 수있는 필드의 전망을 검사합니다. 이러한 이벤트의 확률적 특성은 지루한이 프로세스를 렌더링하고,이 접근법에 의해 세포 - 세포 접촉 초기 또는 덧없는 이벤트를 관찰하기가 어렵습니다. 이 방법은 접촉의 가장자리에있는 셀 쌍을 발견하고, 그들은 완전의 연락처까지 그들을 관찰 필요하거나하지 않습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해, 우리는 문화의 세포를 위치로 비침습, 비 - 파괴적인, 그러나 신속하고 효과적인 방법으로 광학 트래핑을 사용합니다.
광학 트랩, 혹은 광학 핀셋은 점점 삼차원 4 셀 및 기타 마이크론 크기의 입자를 캡처하고 육체적으로 조작하는 생물 학적 연구에 활용하고 있습니다. 방사선 압력 먼저 관찰 1970 년 5, 6의 광학 트위터 시스템에 적용하고, 첫번째 1987 7 생물 학적 표본을 제어하는 데 사용였습니다. 이후, 광학 핀셋은 생물학적인 현상 8-13 다양한 탐사하는 기술로 성숙했습니다.
우리는 진보로 결정 호스트 세포와 상호 작용을 촉진하는 생리적 환경에서 병원성 생물의 아름다운 공간과 시간적 제어를 제공하기 위해 온도 및 습도 제어 디스크 공촛점 현미경을 회전과 함께 광학 트랩을 통합하여 세포 이미징을 살고 방법 14 설명 연산자. 라이브, immunocompromised 개인 15, 16 (예 : AIDS, 화학 요법 및 장기 이식 환자)에서 잠재적으로 치명적인, 침략 감염을 일으킬 수 캔디다 albicans와 Aspergillus fumigatus, 같은 병원성 미생물은 광학에 인접한 비파괴 레이저 농도를 사용하여 갇혀 이동되었습니다 병원체를 phagocytose 수 macrophages. 고해상도는 빛과 형광 기반의 동영상을 전송 살아있는 세포의 phagocytosis의 초기 이벤트를 관찰할 수있는 능력을 만들었습니다. 면역학의 광범위한 적용을 설명하기 위해, 기본 T - 세포는 또한 갇혀 있단에 반대 인 경우에는 3 번 CD에 들어 코팅 microspheres와 시냅스를 형성 조작 및 버렸네 형성의 시간 저속 영상도 얻은되었습니다. 면역 세포에 관하여 사는 병원균의 훌륭한 공간적 제어를 발휘하는 방법을 제공함으로써, 세포의 상호 작용은 세포에 최소한의 섭동과 형광 현미경에 의해 캡처 수 있으며, 타고난과 적응 면역 반응의 초기에 강력한 통찰력을 얻을 수 있습니다.
Protocol
1. 광학 트래핑에 대한 병원균의 문화 조건
- 3 일간 30 SBD (Sabouraud 덱스 트로 오스)이있는 세미 솔리드 한천 미디어 ° C에서 A. fumigatus (B-5233/RGD12-8)을 성장.
- C. 그로 30 흔드는 인큐베이터에 하루 100 μg / ML 암피실린를 포함하는 YPD에 albicans (SC5314) (효모 - 펩톤 덱스 트로 오스) 액체 문화 ° C.
2. 형광 라벨에 대한 병원균의 준비
- 수확은 병원균의 양을 원하는과 1.5 ML 반응 관에 전송할 수 있습니다.
- 인산염의 추가 300 μL 반응 관에 호수 (PBS)를 버퍼.
- 30 초 동안 혼합 Sonicate.
- 1 분 4,000 rpm으로 원심 분리기.
- 펠렛은 그대로두고, 뜨는을 대기음.
- 반복 (2.4)과 (2.5) 두 번 더.
- PBS의 500μL에 Resuspend.
3. 형광 염색과 병원균의 라벨링
- 100 μL dimethylformamide (DMF) (10 MG / ML의 농도)에 대한 관심의 색소 (예 : 알렉사 플루어 488 알렉사 플루어 647) 1 MG를 디졸브.
- 세탁 병원체를 포함하는 반응 튜브에 색소 혼합 3 μL를 추가합니다.
- ° C 1 시간을 회전 또는 37 샘플을 흔들.
- 1 분 4,000 rpm으로 centrifuging하여 PBS 배와 샘플을 씻으십시오.
- PBS 300 μL에 Resuspend.
4. 전체 혈액에서 T - 세포를 수확
- 전체 혈액을 (신선한) 구합니다.
- 따뜻한 피, PBS + 2% 태아 소 혈청 (FBS) 및 실온에 histopaque.
- 전체 혈액의 50 μL / ML에서 RosetteSep 인간의 CD4 + T 세포 농축 칵테일을 추가합니다.
- 샘플을 회전하고 실온에서 20 분 동안 품어.
- PBS + 2퍼센트 FBS의 동일한 볼륨 샘플을 희석하고 부드럽게 섞는다.
- 레이어 혼합 최소화 histopaque 위에 샘플을 희석
- 브레이크 해제와 함께 실온에서 1,200 XG에서 20 분 동안 원심 분리기.
- 강화 세포를 제거합니다.
- PBS + 2퍼센트 FBS 솔루션으로 2 배 강화 세포를 씻으십시오.
- 적혈구 세포 lysing 버퍼 2 분 동안 적혈구를 Lyse
- 5 분 PBS + 2퍼센트 FBS와 1,500 rpm으로 원심 분리기 lysed 적혈구 10 ML 추가
- 펠렛을 방해하지 않도록주의, 뜨는 기음
- 10% 태아 소 혈청을 포함 IMDM 미디어에 Resuspend
5. 챔버 슬라이드로 RAW 264.7 macrophages의 준비
- DMEM (Dulbecco의 수정 이글의 매체) 10 % FBS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신,, 1 % L - 글루타민을 포함 준비.
- 따뜻한 목욕에서 37로 따뜻한 미디어, 트립신, 그리고 PBS ° C.
- PBS로 플레이트 2X 와시
- 각 씻어 사이의 PBS를 대기음.
- (10cm 조직 문화 접시) 표면을 커버하기 위해 판 5 ML의 트립신을 추가합니다.
- 37 5 분 품어 ° C.
- 천천히 강판 표면의 세포를 분리하기 위해 접시의 측면을 노크. 접시 이외의 트립신을 시작하지 않도록주의하십시오.
- 5 ML 또는 트립신 미디어의 상당 금액을 추가합니다.
- 반응 관에 혼합 대기음.
- 3 분 1,000 XG에 원심 분리기.
- 기음 미디어, 펠렛을 방해하지 않도록주의하십시오.
- 미디어 10 ML에 Resuspend.
- 챔버 슬라이드의 각 회의소 미디어 400 μL를 추가합니다.
- 각 챔버에 세포 현탁액의 5 μL를 추가합니다.
- 37 인큐베이터에서 하룻밤 성장 ° C 5% CO 2.
6. 샘플로 병원균의 추가
- 관심 분류 병원균의 Pipet 5-10 μL (단계 1-3에서) 챔버로.
- 준수 macrophages 방해하는 챔버의 바닥을 만지지 않도록 조심하고 아래로 pipeting에 의해 철저히 섞는다.
7. 디스크 공촛점 현미경을 회전에 샘플을로드하면 (비디오, 구성 요소를 통해 스캔)
- 디스크 공촛점 현미경을 회전하기 위해 모든 구성 요소를 켭니다.
- DIC 이미징에 대한 현미경을 맞춥니다.
- 인큐베이터에서 챔버 슬라이드를 제거합니다.
- 전문 단계로 챔버 슬라이드를 삽입합니다.
- 챔버 슬라이드 위로 (DIC 이미징에 필요한)를 제거합니다.
8. 광학 트래핑을위한 준비 (비디오, 구성 요소를 통해 스캔 방법은 현미경으로 통합)
- 광학 함정에 셔터를 켭니다.
- IR 레이저를 켜십시오.
- 광학 트랩을 열고 셔터 (레이저에서).
- IR 레이저 앞에서 셔터를 확인은 IR 카드를 선택하여 닫힙니다.
9. 광학 트랩과 함께 선택과 병원균의 조작
- 준수 슬라이드에 macrophages에 중점을두고 있습니다.
- macrophages에 인접한 용액에 자유롭게 변동 병원체를 찾습니다.
- 병원체는 트랩의 주변에 그러한 단계로 이동합니다.
- 셔터를 열고 함정을 갖습니다.
- 정지 함정과 접촉에 macrophages을 제공할 샘플을 이동페드 병원체.
- DIC, 형광, 또는 두 가지 모두의 조합하거나, 디스크 공촛점 현미경을 회전과 이미지. 일반적으로, 트래핑은 DIC에 완료하고, 실시간 영상은 형광하여 이루어집니다.
10. 대표 결과 :
생체내의 및 체외 환경에서 병원균과 구슬의 전체 공간과 시간적 컨트롤을 발휘하기 위해, 우리는 회전하는 디스크 공촛점 현미경 (개략도는 그림에 표시됩니다. 1)에 통합되어 사용자 정의 - 기본 트래핑 장치를 설계. 풀 가동, 레이저 전원이 350 MW를 제공하고 광학 트랩 장치의 다양한 광학 구성 요소로 빛을 결합 후, 같은 전력 측정기로 측정 TIRF 목표에 전력 ~ 80 MW는, 트랩을 형성하는 데 사용된 챔버 인치
트래핑 레이저로 고정 갇힌 개체를 누른 상태에서 개체에 갇힌 상대 챔버에서 개체를 위치하기 위해서는, 무대가 이동되었습니다. 무대는 갇힌 입자에 드래그 힘이 최대 트래핑 포스를 초과하지 않았 있도록, 속도가 느린 정도 판매율에서 이동되었습니다.
C. albicans 별도의 인구 (전형적인 크기 - ~ 5 μm의)는 여러 형광 채널 영상을 보여주는 세 가지 색상 각각 (AF488, AF568, 그리고 AF647, 초록, 파랑, 대응 및 그림 빨강, 각각)와 라벨이 붙지만 동시에 광학 병원체를 막고있는 동안. 하나의 C. 회색 화살표로 표시로 albicans는에도 붐비는 환경에서 운영자가 선택한 하나의 병원체의 특정 위치 (그림 2A)을 캡처하여 조작할 수있는 능력을 보여주는, 다른 효모의 클러스터를 통해 사각형 패턴에 갇혀 및 이동되었습니다 .
추가 병원성 미생물에 의해 전시 여러 가지 형상 morphologies 함정이 시스템의 유연성을 설명하기 위해 광학 트위터도 C를 유지하고 ...을 놓다 수있었습니다 pseudohyphae로 albicans 입자. C. 흰색 화살표로 명시된 및 형광 GFP - LC3 - RAW 세포 (그림 2B) 옆에 위치로 AF647 (적색)으로 표시 albicans는 궤도를 따라 이동했다. C.의 효모 부분 pseudohyphae 같이 붙여으로 albicans가 덫에 걸렸다.
우리는 또한이 특정 세포 라인과 병원균 (그림 3A)와 phagocytosis의 절대 시간 프레임을 분석하기 위해 RAW 마우스 대식 세포 세포 옆에 Aspergillus fumigatus에 위치. 일단 병원균이 세포와 접촉하게, 트랩이 해제되어, 시간 - 저속 영상은 (그림 3B) 이후 세포 사건을 관찰하는 고용됩니다. 광학 트랩도 혈액에서 분리 구슬 (그림 4) 면역 버렸네를 형성하는 T - 세포 위해서는 안티 인 경우에는 3 번 CD에 들어 항체로 코팅 구슬에 인접한 이동 기본 T - 세포를 캡처하는 데 사용되었다, 추가를 보여 다용도 직접 트랩 및 면역 세포를 조작합니다.
그림 1. 결합 광학 트랩 및 방적 디스크 공촛점 현미경 설정의 개요 및 개략도. 트래핑 빔 (보라색), 브라이트 영상 (오렌지), 형광 여기 빔 (적색), 형광 방출 (녹색), 전하 결합 소자 (CCD) 카메라를위한 조명 경로 전자 - 곱하여 요금 결합 장치를 보여주는 악기 레이아웃 (EM - CCD) 카메라, 이색성 거울 (D1 및 D2), 거울 (M1과 M2) 및 렌즈 (L1, L2, L3, L4). 트랩 - 공촛점 현미경 시스템의 다른 모든 구성 요소는 그림에 표시됩니다.
그림 2. (A)의 형광 이미지 갇혀 C를 조작 albicans. 다른 찬란 - 분류 C.의 분야에 갇힌 찬란 - 라벨 (알렉사 플루어 488 (AF488), 청색) 유기체 albicans (AF568, AF647 초록, 빨간색). 무대는 같은 회색 화살표로 표시 갇혀, 파란색 CA 입자 주위에 이동됩니다. C.의 (B) 빠진 의사 hyphal 형태 GFP - LC3 RAW 셀 옆에 albicans. CA의 찬란 분류 psuedohyphal 양식 (빨강, AF647) 광학 갇혀 GFP - LC3에 인접한 이동은 RAW macrophages을 표명했다. 흰색 화살표로 CA의 유기체가 궤도를 따라 이동합니다.
그림 3. 트래핑과 A.의 위치 phagocytic RAW 셀 옆에 fumigatus. 갇혀 A.의 (A) 브라이트 이미지 fumigatus,처럼 빨간색 화살표로 표시된 경로를 따라 이동과 위치, 흰색 화살표로 표시. 갇혀있는 병원체는 초점 약간 약간 초점 평면 위의 유기체를 밀어 트랩에 의한 것입니다. 답변 그것이 원하는 RAW 세포에 인접한 위치까지 fumigatus가 이동합니다. (B) 독감A.의 phagocytosis의 orescence 이미징 RAW 세포에 의해 fumigatus. 함정 병원체가 RAW 세포 옆에 배치되면 phagocytosis 프로세스가 활성화됩니다. 30 S에서 RAW 세포의 막이 입자 주위 한잔을 변경하고 형성하기 시작합니다. 60 S에서는 컵 완전히 형성된다. 90 년대부터 150s, A.로 fumigatus가 가득 채우고 있으며, 180 S에 의해 입자가 완전히 internalized입니다
그림 4. 안티 인 경우에는 3 번 CD에 들어있는 구슬 항체 코팅 옆에 위치로 광학 트랩 감동 T - 세포 기본의 기본 T - 세포 안티 인 경우에는 3 번 CD에 들어 코팅 구슬로 버렸네를 형성합니다. DIC 이미지 트래핑. 세포 그런 다음 이미지에 쉽게 분별 수없는 면역 버렸네를 형성한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
5 μm의 -이 작품에서 우리는 3 μm의 사이의 크기와 병원균을 캡처하는 광학 트랩을 사용합니다. 저희 연구실에 관심이 병원균은 일반적으로 이러한 차원을 가지고 있지만, 여기에 설명된 광학 트위터 시스템은 크기의 큰 범위를 함정에 융통성이 있습니다. 사실 광학 트랩은 단일 원자의 직경 약 10 μm의 세포에 이르기까지 입자를 캡처하는 데 사용되었습니다. 원형, 타원형, 그리고 생물 학적 병원균과 함께 작업할 때 유용합니다 매우 길쭉한 입자 : 또한,이 광학 트래핑 시스템은 다양한 형태의 입자를 포착 수있었습니다.
이 방법, phagocytosis와 버렸네 형성과 함께, 실시간으로 조사되었고, 세포 표면에 구조적 변화 분석했다. 셀 옆에 위치 입자에 의해, 살아있는 병원균은 제어 및 phagocytic 기계를 활성화하고 살아있는 세포의 면역 반응을 연구하고 phagocytosis의 전체 과정을 통해 이벤트의 절대 시작을 모니터하고 조작했다. 그 결과, phagocytic 행사와 기계의 전체 변화는 정확하게 측정할 수 있습니다. 우리는 A.의 phagocytosis를 따라 병원체로 fumigatus는 대식 세포 옆에 배치하고, 입자가 가득 채우고되면서 초기 막 변화를 본 것입니다. 우리는 정확하게 우리가 그 과정은 병원체의 위치에서 시작하고 싶을 때 제어하여이 과정의 전체 기간을 측정할 수 있었다. 이 기술은 또한 T - 세포 기본으로 관찰 버렸네 형성까지 확장되었다. 광학 트위터가 안티 인 경우에는 3 번 CD에 들어 항체 코팅 구슬 옆에 T - 세포 이동 및 버렸네 형성은 실시간으로 볼 수 있습니다.
우리의 지식,이 방법은 phagocytic 세포 옆에 병원체를 제어하고 조작을 가장 먼저이며, 공촛점 현미경과 conjuction에서 회절 - 제한과 3 차원에 phagocytosis의 절대 시작과 끝을 기록하고 시각화하는 데 사용된 spatio - 현세의 해상도. 이 기술은 또한 제어 및 면역 시냅스를 공부하는 기본 T - 세포를 조작, 생물 응용 프로그램의 다양한이 악기의 다목적를 설명하기 위해 이용되었다. Google 시스템은 fluorophores의 다양한 영상을 지원, UV 여기를 포함하여 다섯 여기 파장을 제공합니다. 트래핑 장치는 많은 기존 epifluorescent 및 공촛점 현미경을 통합 할 수 4.5 피트 2 발자국을 가득 메우고 있습니다. 이 악기는 주로 개체 조작을 위해 설계되었지만, 향후 수정 세포 - 병원체 상호 작용에 biomechanical 세력의 특성을 활성화 것이다 높은 레이저 전원, 비드 위치 감지 기능 등이 포함됩니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 의학 내부 자금의 매사 추세츠 종합 병원과 (JMT, MKM, MLC, JMV), 바이오 메디컬 이미징 국립 연구소 생물 부여 T32EB006348 (CEC), 매사 추세츠 종합 병원의 전산과 통합 생물학 발전 기금을위한 센터 및 AI062773 (지원했습니다 RJH), 보조금 AI062773, DK83756, 그리고 DK 043,351 (RJX), NSF 0,643,745 (MJL), NIH R21CA133576 (MJL), 미 국립 보건원의 알레르기 및 전염병 국립 연구소 (NIAID) (NIH) AI057999 (JMV ). 우리는 기술 지원을하는 데 도움이 토론을 위해 니콜라스 C. 요더 감사하고, 찰스 펠츠 (RPI 주식 회사).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A. fumigatus | Albino strain, B-5233/RGD12-8, gift from K.J. Kwon-Chung, NIH | ||
| C. albicans | SSY50-B mutant, gift from Eleftherios Mylonakis, MGH; SC5314 strain, gift from Gerald Fink, Whitehead Institute | ||
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A20000 | |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A20006 | |
| dimethylformamide | Sigma-Aldrich | D4551 | |
| Fresh blood | Gift from R.J.W. Heath, MGH, HMS | ||
| Nikon inverted microscope | Nikon Instruments | Model Ti-E | |
| Trapping laser, ChromaLase | Blue Sky Research | CLAS-106-STF02-02 | |
| Fluorescence excitation laser | Coherent Inc. | Model Innova 70C | |
| Breadboards for trapping components | Thorlabs Inc. | MB1224, MB1218 | |
| Optical air table | Technical Manufacturing Corp. | ||
| Electronic shutter with pedal control | Uniblitz | Purchased from Vincent Associates, Rochester, NY | |
| Singlemode optical fiber | Oz Optics | PMJ-3S3S-1064-6 | |
| Fiber positioner | Thorlabs Inc. | PAF-X-5-C | |
| Fiber collimator | Oz Optics | HPUCO-23-1064-P-25AC | |
| Lenses for telescope | Thorlabs Inc. | AC254-150-B | Focal length of 150 mm |
| Translation stages (x, y, z) | Newport Corp. | M-461-XYZ | |
| IR dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | ET750-sp-2p8 | |
| Objective lens (100X) | Nikon Instruments | NA = 1.49, oil immersion, TIRF objective | |
| Confocal head | Yokogawa | CSU-XI | |
| Polarizer | Nikon Instruments | MEN51941 | |
| Wollaston prism | Nikon Instruments | MBH76190 | |
| EM-CCD camera | Hamamatsu Corp. | C9100-13 | |
| CCD camera (ORCA ER) | Hamamatsu Corp. | C4742-80-12AG | |
| Filter wheel | Ludl | 99A353 | |
| Filter wheel | Sutter Instrument Co. | LB10-NWE | |
| Chambered coverglass | Lab-Tek | 155409 | |
| Dynabeads | Invitrogen | 111-51D | Coated with anti-CD3 |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Invitrogen | 10313 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Fetal Bovine Serum (HyClone) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30071.03 |
References
- Grakoui, A. The immunological synapse: A molecular machine controlling T cell activation. Science. 285, 221-227 (1999).
- Monks, C. R. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
- Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. Phagocytosis and comparative innate immunity: Learning on the fly. Nat Rev Immunol. 8, 131-141 (2008).
- Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Rev Sci Instrum. 75, 2787-2809 (2004).
- Ashkin, A. Optical trapping and manipulation of neutral particles using lasers. Proc Natl Acad Sci USA. 94, 4853-4860 (1997).
- Ashkin, A. Acceleration and trapping of particles by radiation pressure. Phys Rev Lett. 24, 156-159 (1970).
- Ashkin, A., Dziedzic, J. Optical trapping and manipulation of viruses and bacteria Science. Nature. 235, 1517-1520 (1987).
- Khalil, A. S. Single M13 bacteriophage tethering and stretching. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 4892-4897 (2007).
- Khalil, A. S. Kinesin's cover-neck bundle folds forward to generate force. Proc Natl Acad Sci USA.. 105, 19247-19252 (2008).
- Li, Z. Membrane tether formation from outer hair cells with optical tweezers. Biophys J. , 1386-1395 (2002).
- Kim, S. The αβ T cell receptor is an anisotropic mechanosensor. J Biol Chem. 284, 31028-31028 (2009).
- Mohanty, S., Mohanty, K., Gupta, P. Dynamics of interaction of RBC with optical tweezers. Opt. Express. 13, 4745-4751 (2005).
- Tam, J. Control and manipulation of pathogens with an optical trap for live cell imaging of intercellular interactions. PLoS One. 5, e15215-e15215 (2010).
- Lin, S. J., Schranz, J., Teutsch, S. M. Aspergillosis case-fatality rate: Systematic review of the literature. Clin Infect Dis.. 32, 358-366 (2001).
- Wey, S. B. Hospital-acquired candidemia - the attributable mortality and excess length of stay. Arch. Intern. Med. 148, 2642-2645 (1988).
