Summary
Une méthode est décrite de sélectionner individuellement, manipuler, et les agents pathogènes d'image en direct en utilisant un piège optique couplé à un microscope à disque rotatif. Le piège optique offre un contrôle spatial et temporel des organismes et les places adjacentes aux cellules hôtes. La microscopie à fluorescence capture dynamique des interactions intercellulaires avec perturbation minimale pour les cellules.
Abstract
Dynamique imagerie des cellules vivantes permet la visualisation directe des interactions en temps réel entre les cellules du système immunitaire 1, 2, cependant, le manque de contrôle spatial et temporel entre les cellules phagocytaires et de microbe a rendu concentré observations sur les interactions initiale de réponse de l'hôte aux pathogènes difficiles. Historiquement, les événements de contact intercellulaire comme la phagocytose 3 ont été imagées par mélange de deux types de cellules, puis continue la numérisation du champ de vue de trouver des contacts intercellulaires fortuite au stade approprié de l'interaction. La nature stochastique de ces événements rend ce processus fastidieux, et il est difficile d'observer des événements précoces ou fugace contact cellule-cellule par cette approche. Cette méthode nécessite de trouver des paires de cellules qui sont sur le point de contact, et les observer jusqu'à ce qu'ils consomment leur contact, ou n'en ont pas. Pour remédier à ces limitations, nous utilisons piégeage optique comme un non-invasive, méthode non destructive, mais rapide et efficace pour positionner les cellules en culture.
Pièges optiques, ou des pinces optiques, sont de plus en plus utilisés dans la recherche biologique de capturer et de manipuler physiquement les cellules et d'autres particules de taille micronique en trois dimensions 4. La pression de radiation a été observé pour la première et appliquée aux systèmes de pinces optiques en 1970 5, 6, et a d'abord été utilisée pour contrôler les échantillons biologiques en 1987 7. Depuis lors, pinces optiques ont mûri en une technologie à la sonde une variété de phénomènes biologiques 8-13.
Nous décrivons une méthode 14 que les progrès de l'imagerie cellulaire direct en intégrant un piège optique avec la filature de microscopie confocale disque avec contrôle de température et d'humidité pour fournir exquise de contrôle spatial et temporel des organismes pathogènes dans un environnement physiologique pour faciliter les interactions avec les cellules de l'hôte, tel que déterminé par le opérateur. Live, les organismes pathogènes comme Candida albicans et Aspergillus fumigatus, qui peut causer potentiellement mortels, d'infections invasives chez les personnes immunodéprimées 15, 16 (par exemple le sida, la chimiothérapie, les patients et l'orgue de transplantation), ont été piégés optiquement en utilisant des intensités laser non-destructif et déplacé à côté de macrophages, qui peuvent phagocyter l'agent pathogène. Haute résolution, transmis des films légers et basées sur la fluorescence a créé la possibilité d'observer les événements précoces de la phagocytose dans les cellules vivantes. Pour démontrer la large applicabilité de l'immunologie, les cellules T primaires ont également été piégés et manipulés pour former des synapses avec l'anti-CD3 microsphères enrobées in vivo, et imagerie time-lapse de la formation des synapses a également été obtenue. En fournissant une méthode d'exercer fines contrôle spatial de pathogènes vivants à l'égard de cellules immunitaires, les interactions cellulaires peuvent être capturés par microscopie à fluorescence avec une perturbation minimale pour les cellules et peut donner un aperçu puissante dans les réponses précoces de l'immunité innée et adaptative.
Protocol
1. Les conditions de culture de pathogènes pour le piégeage optique
- Cultivez A. fumigatus (B-5233/RGD12-8) sur une gélose semi-solide contenant SBD (Sabouraud dextrose) à 30 ° C pendant 3 jours.
- Cultivez C. albicans (SC5314) dans YPD (levure-peptone dextrose) culture liquide contenant 100 ug / ml d'ampicilline nuit dans un incubateur agité à 30 ° C.
2. Préparation des agents pathogènes pour marquage fluorescent
- Récolte désiré quantité d'agents pathogènes et le transfert d'un tube de 1,5 ml de réaction.
- Ajouter 300 ul de tampon phosphate salin (PBS) pour tube de réaction.
- Soniquer mélange pendant 30 secondes.
- Centrifuger à 4000 rpm pendant 1 minute.
- Aspirer le surnageant en laissant intactes granulés.
- Répéter (2,4) et (2,5) deux fois plus.
- Remettre en suspension dans 500μL de PBS.
3. Étiquetage des agents pathogènes par un colorant fluorescent
- Dissoudre 1 mg de colorant d'intérêt (par exemple, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647) dans 100 uL diméthylformamide (DMF) (concentration de 10 mg / ml).
- Ajouter 3 pi de mélange de colorants à des tubes de réaction contenant des agents pathogènes lavés.
- Rotation ou secouer l'échantillon à 37 ° C pendant 1 heure.
- Laver l'échantillon avec du PBS 3X par centrifugation à 4000 rpm pendant 1 minute.
- Remettre en suspension dans 300 ul de PBS.
4. La récolte de cellules T dans le sang total
- Obtenir le sang total (frais).
- Sang chaud, PBS + 2% de sérum bovin fœtal (FBS), et histopaque à température ambiante.
- Ajouter CD4 RosetteSep homme + Cocktail T enrichissement cellulaire à 50 ul / ml de sang total.
- Rotation de l'échantillon et incuber pendant 20 minutes à température ambiante.
- Diluer l'échantillon avec un volume égal de PBS FBS + 2% et mélanger doucement.
- Couche diluée de l'échantillon sur le dessus de histopaque, en minimisant le mélange
- Centrifuger pendant 20 minutes à 1200 xg à température ambiante avec le frein off.
- Retirez les cellules enrichies.
- Laver les cellules avec du PBS enrichi 2x + FBS solution à 2%.
- Lyse des globules rouges pendant 2 minutes avec un tampon de lyse des globules rouges du sang
- Ajouter 10 ml de FBS PBS + 2% et centrifuger les globules rouges lysés à 1500 rpm pendant 5 minutes
- Aspirer le surnageant, attention à ne pas perturber le culot
- Remettre en suspension dans les médias IMDM contenant 10% de sérum de veau fœtal
5. Préparation de macrophages RAW 264.7 en diapositives de chambre
- Préparer DMEM (milieu de Eagle modifié par Dulbecco a) pour contenir 10% de FBS, 1% de pénicilline / streptomycine et 1% de L-glutamine.
- Média chaud, la trypsine, et PBS en bain chaud à 37 ° C.
- Laver 2x plaque avec du PBS
- Aspirer PBS entre chaque lavage.
- Ajouter 5 ml de trypsine à l'assiette pour couvrir la surface (pour une plaque de 10 cm de culture de tissu).
- Incuber pendant 5 min à 37 ° C.
- Doucement frapper côté de la plaque pour détacher les cellules de la surface de la plaque. Soyez prudent de ne pas éclabousser la trypsine en dehors de la plaque.
- Ajouter 5 ml ou l'équivalent des médias à la trypsine.
- Aspirer le mélange dans un tube de réaction.
- Centrifuger à 1000 xg pendant 3 minutes.
- Aspirer les médias, attention à ne pas perturber le culot.
- Remettre en suspension dans 10 ml de médias.
- Ajouter 400 ul de médias pour chaque chambre de la glissière de chambre.
- Ajouter 5 pi de suspension cellulaire à chaque chambre.
- Cultivez la nuit dans l'étuve à 37 ° C avec 5% de CO 2.
6. Ajout d'agents pathogènes d'échantillons
- UL Pipet 5-10 de pathogènes étiquetés d'intérêt (à partir des étapes 1-3) dans la chambre.
- Mélanger soigneusement en pipetage haut et en bas, attention à ne pas toucher le fond de la chambre de déranger les macrophages respectées.
7. Chargement échantillon sur le disque tourne microscope confocal (en vidéo, de numérisation grâce à des composants)
- Allumez tous les composants à la filature de microscope confocal à disque.
- Aligner microscope pour l'imagerie DIC.
- Retirer glisser la chambre de l'incubateur.
- Insérez glisser chambre en scène spécialisé.
- Retirer haut de glisser la chambre (nécessaire pour l'imagerie DIC).
8. Préparation pour le piégeage optique (en vidéo, de numérisation grâce à des composants et la façon dont elle est intégrée dans le microscope)
- Allumez le déclencheur pour piège optique.
- Allumez le laser IR.
- Obturateur ouvert (sur le laser) pour piéger optique.
- Confirmer l'obturateur en face du laser IR est fermé par la vérification avec la carte IR.
9. Sélection et manipulation de l'agent pathogène avec piège optique
- Focus sur les macrophages sur la diapositive collée.
- Trouver pathogènes librement fluctuants en solution adjacent à macrophages.
- Déplacer scène, tels que l'agent pathogène est à proximité de la trappe.
- Ouvrez l'obturateur et d'engager le piège.
- Déplacer l'échantillon d'apporter des macrophages en contact avec le piège stationnairespathogène PED.
- Image avec disque tournant microscope confocal, soit en DIC, fluorescence, ou une combinaison des deux. Typiquement, le piégeage se fait en DIC et imagerie en temps réel se fait avec la fluorescence.
10. Les résultats représentatifs:
Pour exercer le plein contrôle spatial et temporel des pathogènes et des perles dans un in vivo et in vitro dans l'environnement, nous avons conçu un appareil de piégeage sur mesure intégrés sur un microscope confocal à disque rotatif (schéma fig. 1). A pleine puissance, le laser fourni 350 mW de puissance et après couplage à la lumière avec les différents composants optiques de l'appareil piège optique, ~ 80 mW de puissance à l'objectif FRBR, telle que mesurée avec un compteur d'électricité, a été utilisé pour former le piège dans la chambre.
Afin de positionner un objet dans la chambre par rapport à l'objet piégé, le stade a été déplacé tout en maintenant l'objet piégé stationnaire avec le laser de piégeage. L'étape a été déplacé à ralentir la vitesse suffisante, de sorte que la force de traînée sur les particules piégées ne dépasse pas la force de piégeage maximale.
Populations distinctes de C. albicans (taille typique - ~ 5 um) ont été marquées avec chacun des trois couleurs (AF488, AF568, AF647 et, correspondant au vert, bleu et rouge sur la figure, respectivement) pour illustrer l'imagerie avec de multiples canaux de fluorescence tout en piégeant optiquement l'agent pathogène. Un seul C. albicans a été piégé et a déménagé dans un modèle carré grâce à un cluster de levure d'autres, comme indiqué par des flèches grises, démontrant la capacité de capturer et de manipuler l'emplacement précis d'un agent pathogène unique choisi par l'opérateur, même dans un environnement encombré (figure 2A) .
Pour illustrer encore la flexibilité de ce système pour piéger les morphologies différentes formes exposées par des organismes pathogènes, la pince optique a également été en mesure de détenir et de situer un C. particules albicans avec un pseudohyphes. Le C. albicans étiquetés avec AF647 (rouge) a été déplacé sur une trajectoire comme indiqué par la flèche blanche et placé à côté de cellules GFP-LC3-RAW fluorescentes (figure 2B). La portion de levure de la C. albicans a été piégé comme pseudohyphes traînait.
Nous avons également placé Aspergillus fumigatus à côté d'un macrophage de souris RAW afin d'analyser les délais absolue de la phagocytose avec cette lignée cellulaire particulier et pathogène (figure 3A). Une fois que l'agent pathogène est en contact avec la cellule, le piège est éteint, et imagerie time-lapse est utilisé pour observer les événements ultérieurs cellulaire (figure 3B). Le piège optique a également été utilisé pour capturer primaires de cellules T isolées de sang et réalisé à côté de billes recouvertes d'anticorps anti-CD3 pour que les cellules T pour former une synapse immunologique avec le talon (fig. 4), montrent l'supplémentaires polyvalence directement piège et de manipuler des cellules immunitaires.
Figure 1. Vue d'ensemble et schématique du piège optique combinée et la filature de configuration de microscope confocal à disque. Mise Instrument montrant le faisceau de piégeage (violet), voie d'éclairage pour fond clair d'imagerie (orange), le faisceau d'excitation de fluorescence (rouge), émission de fluorescence (vert), charge-coupled device (CCD), dispositif de charge de l'électron-multipliant couplé (EM- CCD), miroirs dichroïques (D1 et D2), miroirs (M1 et M2), et les lentilles (L1, L2, L3, L4). Toutes les autres composantes du système de microscope confocal pièges sont étiquetés dans la figure.
Figure 2. (A) des images de fluorescence de piégés et manipulés C. albicans. Un piégés marqués à la fluorescence (Alexa Fluor 488 (AF488), bleu) l'organisme dans un domaine d'autres marqués à la fluorescence C. albicans (AF568, AF647 vert et rouge). La scène est déplacé autour de la piégés, CA particules bleu comme indiqué par les flèches grises. (B) Trapped pseudo-hyphes forme de C. albicans côté de la GFP-LC3 cellules RAW. Marqués par fluorescence sous forme psuedohyphal de CA (rouge, AF647) optiquement piégés et déplacé à côté de la GFP-LC3 exprimée macrophages RAW. L'organisme CA est déplacée le long de la trajectoire, comme indiqué par la flèche blanche.
Figure 3. Piégeage et le positionnement de A. fumigatus côté d'une cellule phagocytaire RAW. (A) des images en fond clair d'un A. piégés fumigatus, comme indiqué par la flèche blanche, déplacé et positionné le long du chemin, comme indiqué par la flèche rouge. L'agent pathogène est emprisonné légèrement floue en raison de la trappe poussant l'organisme légèrement au-dessus du plan focal. A. fumigatus est déplacé jusqu'à ce qu'il soit placé à côté de la cellule souhaitée RAW. (B) la grippeimagerie orescence de la phagocytose de A. fumigatus par la cellule de RAW. Après l'agent pathogène piégée est placée à côté d'une cellule de RAW, le processus de phagocytose est activé. A 30 s, la membrane de la cellule RAW commence à changer et à former une coupe autour de la particule. A 60 s, la coupe est entièrement formé. De 90s à 150s, le A. fumigatus est englouti, et en 180 s, la particule est entièrement internalisée
Figure 4. Le piégeage des cellules T primaires pour former des synapses avec les anticorps anti-CD3 billes revêtues. DIC images d'une primaire à cellules T déplacé par le piège optique d'une position à côté d'un revêtement billes avec anticorps anti-CD3. La cellule se forme alors une synapse immunologique, qui ne peuvent pas être facilement discerné dans les images.
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Discussion
Dans ce travail, nous utilisons un piège optique pour capturer les agents pathogènes de dimensions comprises entre 3 um - 5 um. Bien que les agents pathogènes d'intérêt pour notre laboratoire ont généralement ces dimensions, le système de pince optique décrite ici est flexible pour piéger une large gamme de tailles. En effet pièges optiques ont été utilisés pour capturer les particules allant de simples atomes aux cellules environ 10 um de diamètre. De plus, ce système de piégeage optique était capable de capturer des particules de formes diverses: sphérique, elliptique, et des particules extrêmement allongé, qui est utile quand on travaille avec des agents biologiques pathogènes.
Avec cette formation méthode, la phagocytose et des synapses, en temps réel, ont été étudiés, et des changements structurels sur la surface cellulaire a été analysée. Par des particules de positionnement côté d'une cellule, d'agents pathogènes vivants ont été contrôlés et manipulés pour activer la machine phagocytose et l'étude de la réponse immunitaire dans les cellules vivantes et de surveiller le commencement absolu d'un événement à travers l'ensemble du cours de la phagocytose. En conséquence, toute l'évolution des événements phagocytaires et les machines peuvent être mesurés avec précision. Nous avons suivi la phagocytose de A. fumigatus que l'agent pathogène est placée à côté d'un macrophage, et regardé les changements de membrane initiale des particules a été englouti. Nous avons pu mesurer avec précision la période entière de ce processus en contrôlant quand nous avons voulu que le processus commence par le placement de l'agent pathogène. Cette technique a également été étendu à la formation des synapses observant par des lymphocytes T primaires. La pince optique déplacé d'une cellule T à côté d'un anticorps anti-CD3 revêtement bourrelet, et la formation des synapses peuvent être observées en temps réel.
À notre connaissance, cette méthode est la première à contrôler et manipuler un agent pathogène à côté d'une des cellules phagocytaires, et en conjonction avec la microscopie confocale, a été utilisé pour enregistrer et de visualiser le début et la fin absolue de la phagocytose en trois dimensions avec diffraction limitée spatio- résolution temporelle. La technologie a également été utilisé pour contrôler et manipuler primaires de cellules T à l'étude des synapses immunologiques, illustrant la polyvalence de cet instrument pour une variété d'applications biologiques. Notre système fournit cinq longueurs d'onde d'excitation, y compris excitation UV, permettant l'imagerie d'une variété de fluorophores. L'appareil piégeage occupe une 4,5 pi 2 empreinte, capables d'être intégrés à de nombreux microscopes conventionnels épifluorescence et confocale. Bien que cet instrument a été conçu principalement pour la manipulation d'objets, les futures modifications comprennent la puissance laser plus élevée, perle des capacités de détection de position, etc permettrait la caractérisation des forces biomécaniques dans l'interaction cellule-pathogène.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le Massachusetts General Département Hôpital de fonds de médecine interne (JMT, MKM, le MLC, JMV), Institut national d'imagerie biomédicale et Bioingénierie octroi T32EB006348 (CCE), le Centre du Massachusetts General Hospital pour financer la biologie du développement informatique et intégrative et AI062773 ( RJH), les subventions AI062773, DK83756, et DK 043 351 (RJX), la NSF 0643745 (MJL), NIH R21CA133576 (MJL) et l'Institut national des allergies et maladies infectieuses (NIAID) des Instituts nationaux de la santé (NIH) AI057999 (JMV ). Nous remercions Nicolas C. Yoder pour les discussions utiles, et feutres Charles (RPI, Inc) pour l'assistance technique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A. fumigatus | Albino strain, B-5233/RGD12-8, gift from K.J. Kwon-Chung, NIH | ||
| C. albicans | SSY50-B mutant, gift from Eleftherios Mylonakis, MGH; SC5314 strain, gift from Gerald Fink, Whitehead Institute | ||
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A20000 | |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A20006 | |
| dimethylformamide | Sigma-Aldrich | D4551 | |
| Fresh blood | Gift from R.J.W. Heath, MGH, HMS | ||
| Nikon inverted microscope | Nikon Instruments | Model Ti-E | |
| Trapping laser, ChromaLase | Blue Sky Research | CLAS-106-STF02-02 | |
| Fluorescence excitation laser | Coherent Inc. | Model Innova 70C | |
| Breadboards for trapping components | Thorlabs Inc. | MB1224, MB1218 | |
| Optical air table | Technical Manufacturing Corp. | ||
| Electronic shutter with pedal control | Uniblitz | Purchased from Vincent Associates, Rochester, NY | |
| Singlemode optical fiber | Oz Optics | PMJ-3S3S-1064-6 | |
| Fiber positioner | Thorlabs Inc. | PAF-X-5-C | |
| Fiber collimator | Oz Optics | HPUCO-23-1064-P-25AC | |
| Lenses for telescope | Thorlabs Inc. | AC254-150-B | Focal length of 150 mm |
| Translation stages (x, y, z) | Newport Corp. | M-461-XYZ | |
| IR dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | ET750-sp-2p8 | |
| Objective lens (100X) | Nikon Instruments | NA = 1.49, oil immersion, TIRF objective | |
| Confocal head | Yokogawa | CSU-XI | |
| Polarizer | Nikon Instruments | MEN51941 | |
| Wollaston prism | Nikon Instruments | MBH76190 | |
| EM-CCD camera | Hamamatsu Corp. | C9100-13 | |
| CCD camera (ORCA ER) | Hamamatsu Corp. | C4742-80-12AG | |
| Filter wheel | Ludl | 99A353 | |
| Filter wheel | Sutter Instrument Co. | LB10-NWE | |
| Chambered coverglass | Lab-Tek | 155409 | |
| Dynabeads | Invitrogen | 111-51D | Coated with anti-CD3 |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Invitrogen | 10313 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Fetal Bovine Serum (HyClone) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30071.03 |
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