Summary

Dinamik Canlı Hücre Görüntüleme Konukçu-Patojen Etkileşimleri Çalışma Optik Tuzak

Published: July 28, 2011
doi:

Summary

Ayrı ayrı seçmek işlemek için bir yöntem tarif ve görüntü canlı patojenlerin dönen bir diskin mikroskop optik bir tuzak kullanıyor. Optik tuzak mekansal ve zamansal organizmaların kontrolü sağlar ve konak hücrelerine onları komşu yerleştirir. Floresan mikroskopi hücrelere az pertürbasyon dinamik hücrelerarası etkileşimleri yakalar.

Abstract

Dinamik canlı hücre görüntüleme, bağışıklık sistemi 1, 2 hücreleri arasında gerçek zamanlı etkileşim doğrudan görselleştirme sağlar; Ancak, fagositik hücre ve mikrop arasındaki mekansal ve zamansal kontrol eksikliği patojenlere karşı konak yanıtının ilk etkileşimler içine gözlemler odaklı hale getirdi zordur. Tarihsel olarak, hücrelerarası kişi olaylarının fagositoz 3 gibi iki hücre tipleri karıştırma imaged ve sonra sürekli etkileşim uygun aşamada serendipitous hücrelerarası kişileri bulmak için tarama alan görünümü. Bu olayların stokastik bu sürecin doğa sıkıcı işler ve bu yaklaşım, erken ya da hücre-hücre teması kısacık olaylar gözlemlemek zordur. Bu yöntemi, temas eşiğinde hücre çiftleri bulma ve onlar erdirmek onların iletişim kadar onları gözlemleyerek gerektirir, ya da yoktur. Bu sınırlamaları aşması için, hücre kültürü yerleştirmek için bir non-invaziv, yıkıcı olmayan, ancak hızlı ve etkili bir yöntem olarak optik yakalama kullanın.

Optik tuzaklar, ya da optik cımbız, giderek, hücre ve diğer mikron boyutlu parçacıklar üç boyutlu 4 yakalama ve fiziksel olarak manipüle biyolojik araştırmalarda kullanılmaktadır. Radyasyon basıncı ilk gözlenen ve 1970 5, 6, optik cımbız sistemleri uygulanan ve ilk kez 1987 7 biyolojik örneklerin kontrol etmek için kullanılmıştır. O zamandan beri, çeşitli biyolojik olgunun 8-13 prob optik cımbız bir teknoloji haline gelmişti.

Biz gelişmeler, optik bir tuzak olarak belirlenen ana hücreleri ile etkileşimleri kolaylaştırmak için fizyolojik bir ortamda patojen organizmaların nefis mekansal ve zamansal kontrol sağlamak için sıcaklık ve nem kontrolü ile disk konfokal mikroskopi iplik ile entegre ederek hücre görüntüleme canlı bir yöntem 14 tarif operatörü. Canlı, immün sistemi baskılanmış bireyler 15, 16 (örneğin AIDS, kemoterapi, ve organ nakli), potansiyel olarak ölümcül, invaziv enfeksiyonlara neden Candida albicans ve Aspergillus, patojen organizmalar gibi optik bitişik tahribatsız lazer yoğunlukları kullanılarak yakalanmış ve taşındı makrofajlar, patojen fagosite. Yüksek çözünürlük, ışık ve floresan tabanlı filmler iletilen canlı hücreler fagositoz erken olayları gözlemleme yeteneği kurulmuştur. Immünoloji geniş uygulanabilirliğini göstermek için, birincil T-hücrelerinin sıkışıp kalmasına ve in vivo anti-CD3 kaplı mikrosferler ile sinaps oluşturmak için manipüle ve sinaps oluşumu zaman atlamalı görüntü de elde edildi. Canlı patojenlerin bağışıklık sistemi hücrelerine göre ince mekansal kontrolü uygulamak için bir yöntem sağlayarak, hücresel etkileşimler hücrelere az pertürbasyon floresan mikroskobu ile yakalanan ve güçlü bir anlayış doğal ve adaptif bağışıklık erken cevaplar verebilmesidir.

Protocol

1. Kültür koşulları optik yakalama patojenlerin 3 gün boyunca 30 SBD (Sabouraud dekstroz) içeren yarı-katı agar medya ° C A. fumigatus (B-5233/RGD12-8) büyütün. C. büyütün 30 gece bir çalkalayıcı inkübatör 100 mg / ml ampisilin içeren YPD albicans (SC5314) (Maya Peptonlu Dekstroz) sıvı kültür ° C 2. Floresan etiketlenmesi için patojenlerin hazırlanması Hasat patojenlerin miktarı istenen ve 1.5 ml r…

Discussion

– 5 mikron Bu çalışmada, 3 mikron arasında boyutları ile patojenler yakalamak için optik bir tuzak. Laboratuara ilgi patojenler genellikle bu boyutları olsa da, burada açıklanan optik cımbız sistemi, boyutları çok geniş bir yelpazede yakalamak için esnek. Aslında optik tuzakları tek atomdan hücreleri çapı yaklaşık 10 mikron arasında değişen partiküller yakalamak için kullanılmıştır. Küresel, eliptik ve biyolojik patojenler ile çalışırken yararlı çok uzamış parçacıklar: Ayrıca, …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Tıp İç Fonları Massachusetts Genel Hastanesi Bölümü (JMT, MKM, MLC, JMV) Ulusal Biyomedikal Görüntüleme Enstitüsü ve Biyomühendislik hibe T32EB006348 (MSK), Massachusetts Genel Hastanesi Kullanıcı Hesaplamalı ve Bütünleştirici Biyoloji geliştirme fonu için Merkezi ve AI062773 (tarafından desteklenen oldu RJH), hibe AI062773, DK83756 ve DK 043.351 (RJX), NSF 0.643.745 (MJL), NIH R21CA133576 (MJL) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü (NIAID) (NIH) AI057999 (JMV .) Nicholas C. Yoder teknik yardım için yararlı tartışmalar için teşekkür eder, ve Charles Keçeler (RPI, Inc.)

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
A. fumigatus     Albino strain, B-5233/RGD12-8, gift from K.J. Kwon-Chung, NIH
C. albicans     SSY50-B mutant, gift from Eleftherios Mylonakis, MGH; SC5314 strain, gift from Gerald Fink, Whitehead Institute
Alexa Fluor 488 Invitrogen A20000  
Alexa Fluor 647 Invitrogen A20006  
dimethylformamide Sigma D4551  
Fresh blood     Gift from R.J.W. Heath, MGH, HMS
Nikon inverted microscope Nikon   Model Ti-E
Trapping laser, ChromaLase Blue Sky Research CLAS-106-STF02-02  
Fluorescence excitation laser Coherent   Model Innova 70C
Breadboards for trapping components Thorlabs MB1224, MB1218  
Optical air table Technical Manufacturing Corporation    
Electronic shutter with pedal control Uniblitz   Purchased from Vincent Associates, Rochester, NY
Singlemode optical fiber Oz Optics PMJ-3S3S-1064-6  
Fiber positioner Thorlabs PAF-X-5-C  
Fiber collimator Oz Optics HPUCO-23-1064-P-25AC  
Lenses for telescope Thorlabs AC254-150-B Focal length of 150 mm
Translation stages (x, y, z) Newport M-461-XYZ  
IR dichroic mirror Chroma ET750-sp-2p8  
Objective lens (100X) Nikon   NA = 1.49, oil immersion, TIRF objective
Confocal head Yokogawa CSU-XI  
Polarizer Nikon MEN51941  
Wollaston prism Nikon MBH76190  
EM-CCD camera Hamamatsu C9100-13  
CCD camera (ORCA ER) Hamamatsu C4742-80-12AG  
Filter wheel Ludl 99A353  
Filter wheel Sutter LB10-NWE  
Chambered coverglass Lab-Tek/Nunc 155409  
Dynabeads Invitrogen 111-51D Coated with anti-CD3
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Invitrogen/Gibco 10313  
Penicillin/streptomycin Invitrogen/Gibco 15140-122  
L-glutamine Invitrogen/Gibco 25030-081  
Fetal Bovine Serum (HyClone) ThermoScientific SH30071.03  

References

  1. Grakoui, A. The immunological synapse: A molecular machine controlling T cell activation. Science. 285, 221-227 (1999).
  2. Monks, C. R. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
  3. Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. Phagocytosis and comparative innate immunity: Learning on the fly. Nat Rev Immunol. 8, 131-141 (2008).
  4. Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Rev Sci Instrum. 75, 2787-2809 (2004).
  5. Ashkin, A. Optical trapping and manipulation of neutral particles using lasers. Proc Natl Acad Sci USA. 94, 4853-4860 (1997).
  6. Ashkin, A. Acceleration and trapping of particles by radiation pressure. Phys Rev Lett. 24, 156-159 (1970).
  7. Ashkin, A., Dziedzic, J. Optical trapping and manipulation of viruses and bacteria Science. Nature. 235, 1517-1520 (1987).
  8. Khalil, A. S. Single M13 bacteriophage tethering and stretching. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 4892-4897 (2007).
  9. Khalil, A. S. Kinesin’s cover-neck bundle folds forward to generate force. Proc Natl Acad Sci USA.. 105, 19247-19252 (2008).
  10. Li, Z. Membrane tether formation from outer hair cells with optical tweezers. Biophys J. , 1386-1395 (2002).
  11. Kim, S. The αβ T cell receptor is an anisotropic mechanosensor. J Biol Chem. 284, 31028-31028 (2009).
  12. Mohanty, S., Mohanty, K., Gupta, P. Dynamics of interaction of RBC with optical tweezers. Opt. Express. 13, 4745-4751 (2005).
  13. Tam, J. Control and manipulation of pathogens with an optical trap for live cell imaging of intercellular interactions. PLoS One. 5, e15215-e15215 (2010).
  14. Lin, S. J., Schranz, J., Teutsch, S. M. Aspergillosis case-fatality rate: Systematic review of the literature. Clin Infect Dis.. 32, 358-366 (2001).
  15. Wey, S. B. Hospital-acquired candidemia – the attributable mortality and excess length of stay. Arch. Intern. Med. 148, 2642-2645 (1988).

Play Video

Cite This Article
Tam, J. M., Castro, C. E., Heath, R. J. W., Mansour, M. K., Cardenas, M. L., Xavier, R. J., Lang, M. J., Vyas, J. M. Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging. J. Vis. Exp. (53), e3123, doi:10.3791/3123 (2011).

View Video